Trocadores de Na+/Ca2+: Relação entre estrutura e função

Detalhes bibliográficos
Ano de defesa: 2022
Autor(a) principal: Vitale, Phelipe Augusto Mariano
Orientador(a): Não Informado pela instituição
Banca de defesa: Não Informado pela instituição
Tipo de documento: Tese
Tipo de acesso: Acesso aberto
Idioma: por
Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
Programa de Pós-Graduação: Não Informado pela instituição
Departamento: Não Informado pela instituição
País: Não Informado pela instituição
Palavras-chave em Português:
Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-02122022-164145/
Resumo: Aproximadamente 30% dos genes de organismos eucarióticos e procarióticos codificam para proteínas de membrana, e aproximadamente 60% dos alvos para o desenvolvimento de novas drogas são proteínas de membrana. Apesar disso, as proteínas de membrana correspondem a apenas cerca de 3% das estruturas depositadas no PDB. Os trocadores de Na++/Ca2+ (NCX) são proteínas de membrana absolutamente essenciais para a manutenção da homeostase de Ca2+ em diferentes tipos de células. Eles são formados por 10 hélices transmembranares e uma grande alça citoplasmática. O domínio transmembranar é responsável pelo transporte de Na+ e Ca2+ através da bicamada lipídica, enquanto a alça intracelular é responsável pela regulação alostérica do trocador por Ca2+ intracelular: a ligação de Ca2+ em dois domínios sensores (CBD1 e CBD2) ativa os NCX. Por combinarem domínios transmembranares e globulares conectados por linkers flexíveis, os NCX apresentam um caráter multifacetado, o que torna a sua caracterização estrutural ainda mais difícil. De fato, apesar da reconhecida importância fisiológica, pouco se conhece sobre a estrutura tridimensional dos NCX eucarióticos, e o mecanismo de regulação alostérica permanece pouco compreendido. Nesta tese adotamos o trocador de Drosophila, CALX, como modelo para estudar a estrutura e o mecanismo de regulação alostérica dos trocadores NCX por Ca2+ intracelular. CALX apresenta regulação anômala porque é inibido ao invés de ser ativado por Ca2+ intracelular. Por outro lado, enquanto a ligação de Ca2+ em CBD2 é importante para a regulação alostérica dos NCX, a regulação alostérica do CALX depende exclusivamente da ligação de Ca2+ em CBD1. Para investigar o mecanismo de regulação por Ca2+ intracelular, desenhamos e investigamos por RMN a dinâmica de um mutante do domínio sensor de Ca2+, que contém um linker flexível entre CBD1 e CBD2. Observamos que o linker efetivamente desacoplou a dinâmica entre os dois CBDs, sem afetar significativamente a afinidade por Ca2+. Caracterizamos a atividade dos trocadores NCX e CALX, em células eucarióticas usando técnicas de imageamento de Ca2+. E implementamos um protocolo para a expressão e purificação do trocador Na+/Ca2+ de Methanococcus janaschii (NCX-Mj), isotopicamente enriquecido com 15N, para estudos de RMN em solução. De forma geral, os resultados apresentados nessa tese abrem caminho para a realização de estudos de correlação entre estrutura e função do CALX, e para o estudo do NCX-Mj incorporado em micelas de detergente por RMN em solução.