Estudos estruturais de fragmentos do trocador de Na+/Ca2+ por RMN em solução

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: Stabelini, Tatiana Comporte
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: CALX; Na+/Ca2+ Exchanger; Nuclear Magnetic Resonance; Ressonância Magnética Nuclear; TMH5; Trocador Na+/Ca2+; XIP
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-11122018-091550/

Proteínas de membrana estão envolvidas em processos fisiológicos essenciais como, por exemplo, a manutenção do equilíbrio iônico e sinalização intracelular. No entanto, apesar do envolvimento em inúmeros processos fisiológicos e de grande interesse farmacêutico, o estudo estrutural de proteínas de membrana ainda é um processo custoso e muito mais complexo do que o estudo estrutural de proteínas solúveis. Os trocadores de Na+/Ca2+ são proteínas de membrana que atuam na manutenção da homeostase de Ca2+ intracelular e estão envolvidos em processos patológicos como doenças cardíacas. Estes trocadores estão presentes em diversas espécies de mamíferos (NCX) e insetos, por exemplo, na mosca Drosophila melanogaster (CALX). A topologia destas proteínas é constituída de dois domínios. O domínio transmembranar, que contém dois segmentos de 5 hélices transmembranares (TMH) e é responsável por promover o transporte específico de íons Ca2+ e Na+ através da membrana, e o domínio citoplasmático, responsável por regular a atividade do trocador. O domínio citoplasmático consiste de uma alça que contém dois domínios sensores de Ca2+ intracelular (CBD1 e CBD2). Trabalhos mostraram que o trocador CALX é inibido pela ligação de Ca em CBD1, enquanto que trocadores NCX são ativados. As regiões citosólicas que conectam CBD1 e CBD2 à TMH5 e TMH6 são conservadas e ainda não foram caracterizadas estruturalmente. Adjacente à TMH5 há um segmento anfipático, denominado exchanger inhibitory peptide (XIP), que está envolvido no mecanismo de regulação do trocador. Na ausência de dados estruturais do CALX completo, o estudo de TMH5-XIP poderá aumentar a compreensão sobre a estrutura e o funcionamento do trocador. A construção TMH5-XIP foi fusionada à MBP no N-terminal e a uma sequência de 8 histidinas no C-terminal. Apesar da expressão da proteína de fusão ter sido bem sucedida, problemas de precipitação e ineficiência durante a clivagem da conexão com a MBP impediram a conclusão dos estudos estruturais. Logo, uma construção menor, contendo apenas a região equivalente ao XIP, foi estudada por espectroscopia de RMN em solução e dicroísmo circular. XIP forma uma 310-hélice a baixa temperatura, 7 oC, que se desestabiliza a maior temperatura, 27 oC. Estes dados permitem a formulação de hipóteses sobre o papel de XIP no mecanismo de regulação do domínio transmembranar de CALX.