Clonagem, expressão e caracterização inicial do módulo VapBC-4 de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni

• Ano de defesa: 2020
• Autor(a) principal: Azevedo, Bruna Oliveira Pigatto
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Leptospira; Toxin-Antitoxin; Toxina-Antitoxina; VapBC
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-12092023-093250/

A leptospirose é uma zoonose causada pela bactéria espiroqueta aeróbia do gênero Leptospira, sendo a Leptospira interrogans sorovar Copenhageni uma das maiores responsáveis pelos casos em seres humanos da doença no Brasil. Os sistemas Toxina-Antitoxina (TA) são amplamente distribuídos entre as espécies bacterianas. Este sistema é composto por uma toxina estável e uma antitoxina instável. Sob condições de estresse ocorre a ruptura do equilíbrio deste sistema e as toxinas são liberadas em maior quantidade, impactando moléculas chave em vários processos essenciais como a suspensão reversível do crescimento celular. Os módulos TA são classificados em tipos e famílias sendo que as VapBCs constituem a principal família TA, agrupada devido à homologia de um domínio PIN da toxina que atua como endoribonuclease. O banco de dados TADB mostra que a L. interrogans sorovar Copenhageni linhagem Fiocruz L1-130 possui quatro loci vapBCs, todos no cromossomo I. Em trabalho anterior, o módulo VapBC-3 foi caracterizado quanto aos seus aspectos bioquímicos e funcionais. Dando continuidade a estes estudos, este trabalho teve como principais objetivos avaliar a conservação dos módulos VapBC de L. interrogans sorovar Copenhageni em módulos homólogos a estes em genomas disponíveis de Leptospira spp e a clonagem, expressão, caracterização funcional do módulo de TA VapBC-4. Através dos estudos in sílico, observamos que o gene codificador da toxina vapC-4 estava presente em diferentes Leptospira ssp, demostrando estar bem distribuída entre estirpes de diferentes graus de patogenicidade. Os fragmentos dos genes vapB-4 , vapC-4 , e vapBC-4 foram amplificados e clonados com sucesso. A expressão das proteínas recombinantes foi realizada em E. coli BL21 (DE3), observando-se a presença da maior parte do módulo VapBC-4 e da proteína VapB-4 na fração insolúvel e da VapC-4 na fração solúvel, sendo que a proteína VapC-4 foi obtida com baixo rendimento quando comparada a antitoxina VapB-4, provavelmente por se tratar de uma toxina. As proteínas foram purificadas por IMAC. O efeito tóxico da VapC-4 em E. coli foi avaliado pela cinética de crescimento, indicando que as bactérias que expressam VapC-4 tiveram um crescimento lento quando comparadas às estirpes que expressam VapB-4 e o módulo VapBC-4, sugerindo que VapC-4 pode ter efeito tóxico em E. coli, corroborando com as características atribuídas aos sistemas TA na literatura. Os módulos TA de Leptospira permanecem, em sua maior parte, pouco estudados. Recentemente, trabalhos ao redor do mundo têm identificado como estas toxinas impactam em diversos processos metabólicos, principalmente na adaptação e defesa bacteriana, mas as condições em que isto ocorre e suas inter-relações são questões a serem esclarecidas. Os estudos funcionais de TA são úteis para entender a fisiologia e patologia bacteriana, destacando a necessidade de identificação e caracterização de novos TA.