Construção e caracterização de mini-bibliotecas de EST geradas com RT-PCR de baixa estringencia e clonagem de uma apirase de Schistosoma mansoni

• Ano de defesa: 2003
• Autor(a) principal: Marco, Ricardo de
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Biochemistry; Biologia molecular; Bioquímica; Clonagem; Cloning; Dados de sequência molecular; Molecular biology; Molecular sequence data; Schistosoma (Estudo); Schistosoma (Study); Schistosoma mansoni
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-10052018-143753/

Este trabalho demonstrou a construção de minibibliotecas de \"Expressed Sequence Tags\" (EST) com o uso de RT-PCR de baixa estringencia e \"primer\" consenso-degenerado. Através do estudo de parâmetros críticos como concentração de sais, temperatura e velocidade de ciclagem, composição dos \"primers\" e qualidade do RNA mensageiro, foi possível padronizar um protocolo. Tal protocolo permitiu um aumento do numero de seqüências por minibiblioteca em relação a protocolos similares existentes na literatura (Dias neto et al., 1997 e 2000) sem perda de características desejáveis como amplificação preferencial do centro dos genes e nomalização das mensagens. As seqüências produzidas levaram a um significativo aumento das seqüências de EST de S. mansoni disponíveis publicamente e permitiu a detecção da existência de novos fragmentos de genes expressos na fase adulta do parasita. Neste trabalho também clonamos uma apirase de S. mansoni cuja a seqüência não havia sido descrita anteriormente. O gene possui cerca de 2,7 mil pares de bases e codifica para uma proteína de 544 aminoácidos. Esta foi expressa em sistema heterologo e utilizada para obtenção de anticorpos policlonais contra esta proteína. Utilizando estes anticorpos foi possível detectar a proteína no tegumento do parasita.