Mutação sítio-específica de cisteínas glutationiladas na subunidade α5 do proteassomo 20S da levedura Saccharomyces cerevisiae: implicações no metabolismo de proteínas oxidadas e na longevidade celular.

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Leme, Janaina de Moraes Maciel
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Estresse oxidativo; Glutathionylation; Glutationilação; Oxidative stress; Proteasome; Proteassomo
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/41/41131/tde-22072016-160442/

O proteassomo é uma protease intracelular multimérica e multicatalítica responsável pela degradação de proteínas envolvidas no controle do ciclo celular, processos de sinalização, apresentação antigênica e no controle de síntese proteica. Ele é constituído por uma unidade catalítica central denominada 20S (20SPT) e por unidades regulatórias (19S) acopladas em uma ou ambas as extremidades para formar o 26S (26SPT). O 26SPT reconhece e direciona os substratos poliubiquitinados para a proteólise por um mecanismo dependente de ATP. Entretanto, o 20SPT também é ativo quando dissociado de unidades regulatórias, degradando proteínas independentemente de poliubiquitinação e consumo de ATP. Proteínas modificadas oxidativamente e outros substratos são degradados desta maneira. O 20SPT é composto por dois anéis heptaméricos centrais (β) onde estão localizados os sítios catalíticos e por dois anéis heptaméricos externos (α) que são responsáveis pela abertura da câmara catalítica. Anteriormente, foi observado pelo grupo que o 20SPT da levedura S.cerevisiae sofre S-glutatiolação na subunidade α5 nos resíduos de Cys76 e Cys221. Assim, foram obtidas neste projeto linhagens de levedura S. cerevisiae portando mutações sítio-específicas na subunidade α5 do 20SPT (α5-C76S ou α5-C221S), e posteriormente, ensaios comparativos quanto às consequências estruturais e funcionais dessas mutações foram realizados. Observamos um aumento na capacidade/velocidade de degradação nas atividades peptidásicas e proteolíticas da mutante C221, e também que, a população de proteassomo isolada dessa linhagem apresenta maior proporção da forma aberta da câmara catalítica, sendo esta imediatamente fechada pela remoção da glutationa do 20SPT na presença de DTT. Resultados opostos foram observados na linhagem mutante C76. Identificamos por espectrometria de massas o resíduo C76 do 20SPT glutationilado na mutante C221. Os ensaios fenotípicos mostraram um aumento da longevidade e resistência ao estresse oxidativo da C221, enquanto que a linhagem C76 mostrou uma dificuldade no crescimento. Contudo, a S-glutationilação do 20SPT é uma modificação química pós-traducional reversível de ocorrência fisiológica dependente do estado redox celular, e, o presente trabalho discute a modulação da câmara catalítica do 20SPT através da S-glutationilação de dois resíduos de cisteína localizados na subunidade α5, e as consequências desta modificação na função proteassomal