Clonagem e expressão da Região Hep do domínio de Heparina da Proteína hemaglutinina filamentosa ( FHA) da bactéria Bordella pertussis em sistemas heterólogos

• Ano de defesa: 2003
• Autor(a) principal: Colombi, Débora
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Bordetella Infections; Bordetella pertussis; Coqueluche; FHA; Infecções por Bordetella; Pertussis; Proteínas recombinantes; recombinant proteins; Vaccine; Vacina
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-13112014-173027/

Bordetella pertussis, o agente etiológico da coqueluche ou tosse comprida, que estabelece a infecção através da fixação bacteriana no epitélio do trato respiratório superior. Os principais mediadores de adesão da bactéria são a toxina pertússica (PT) e a hemaglutinina filamentosa (FHA). A FHA é a adesina majoritária e contém pelo menos 4 domínios: porção Nterminal, domínio de reconhecimento de carboidrato (CRD) (FHA1141-1279), trinca de aminoácidos Arginina-Glicina-Ácido aspártico (RGD) (FHA1097-1099) e o sítio de ligação a heparina (domínio Hep) (FHA442-863). Neste trabalho, foi realizado a amplificação de duas regiões do domínio de ligação à heparina, as regiões MAL80 (FHA299-873) e HEP (FHA430-873). As regiões foram amplificadas, clonadas no vetor de expressão pAE, expressas utilizando a cepa BL21 SI de E. coli e purificadas. A proteína HEP purificada de E. coli possui baixa afinidade por heparina e não é capaz de aglutinar hemácias. A proteína recombinante HEP purificada foi utilizada para a produção de anticorpos. Através do experimento de ELISA foi demonstrado que o anti-soro anti-HEP é capaz de reconhecer além da região HEP, a região MAL80 e a proteína FHA. Estes resultados foram confirmados por experimentos de Western. Neste período também foi realizada a amplificação do domínio HEP de FHA e da subunidade S1 da toxina pertússica (PT) de B. pertussis através do método de TAP Express. Este método envolve duas reações de PCR e no final do processo é obtido um fragmento que contém uma região promotora (CMV), uma seqüência codificadora e uma região terminadora (SV40), que está pronto para ser introduzido e expresso em animais. De posse deste material e da proteína recombinante HEP, foi realizado o desafio intracerebral com Bordetella pertussis e através do monitoramento dos camundongos foi observado que nenhum dos candidatos testados foi capaz de proteger os animais contra B. pertussis. Foi realizado também a expressão do domínio Hep em lactobacilos, visando um possível sistema de imunizações de mucosas. Os anticorpos produzidos nos camundongos imunizados com a proteína HEP expressa em E. coli, lactobacilos e por vacina de DNA foram capazes de inibir a hemaglutinação promovida pela proteína FHA.