Caracterização ex vivo e in vivo da enzima β-glicosilceramidase lisossomal recombinante e clonagem celular da linhagem humana com produção permanente dessa molécula

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: Diniz, Gabriella Macedo Mascarenhas
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Camundongo condicional para doença de Gaucher (Mx1/Cre/LoxP); Cre-Lox conditional GBA mutation mouse; Doença de Gaucher; Esfingolipidose; Gaucher disease; Glicosilceramidase recombinante; Human cell line; Linhagem celular humana; Recombinant glucosylceramidase; Sphingolipidosis
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17135/tde-17072024-095627/

A doença de Gaucher (DG) é a doença mais comum dentre as disfunções de armazenamento lisossomal, sendo decorrente de mutações no gene que codifica a enzima &beta;-glicosilceramidase (GBA). A terapia de reposição enzimática com GBA recombinante é a principal forma de tratamento para pacientes com DG, mas ainda é um medicamento de alto custo. Resultados recentes em nosso grupo de pesquisa mostraram, por meio da produção transiente, que a molécula mutGBA está relacionada com elevada atividade biológica e, assim, foi gerada a linhagem celular humana L16_293-FT-P2-mutGBA com produção permanente dessa enzima. Neste trabalho, o objetivo foi continuar a caracterização dessa molécula por meio de ensaios ex vivo e in vivo e realizar a clonagem dessa linhagem celular. A primeira etapa foi realizar o escalonamento da produção da enzima recombinante mutGBA pela linhagem L16_293-FT-P2-mutGBA. Assim, após o cultivo em larga escala foi possível obter 9677 U GBA no sobrenadante da cultura celular, um aumento de 217 x em relação ao cultivo em pequena escala. Na segunda etapa, a molécula mutGBA foi caracterizada por meio de ensaios ex vivo e in vivo em modelo de camundongo condicional para DG e fibroblastos de pacientes. OS fibroblastos de indivíduos saudáveis e indivíduos com DG foram caracterizados quanto o nível das três enzimas GBA (GBA lisossomal, GBA2 e GBA3). Com o uso de inibidores específicos (CBE e NB-DNJ) foi possível demonstrar que fibroblasto de indivíduo saudável produz cerca de 70,9 (+ 3,1) U GBA/mg de proteína e que 30% da atividade enzimática avaliada pelo ensaio fluorimétrico com o substrato sintético 4-MU são relativas as outras enzimas GBAs não lisossomais, sendo desses 70% GBA2 e 30% GBA3. Fibroblastos de pacientes com DG produzem cerca de 6,9 (+ 1,5) U GBA/mg de proteína e a relação para o nível das 3 enzimas GBAs foi a mesma relatada para indivíduos saudáveis. Em seguida, ensaios de uptake da enzima mutGBA e da enzima recombinante comercial (VPRIV) mostraram que as mesmas não são absorvidas por fibroblasto até 6 h de incubação. Análises ex vivo da atividade da enzima GBA em macrófagos em 6 tempos após a infusão de 19 U de mutGBA mostraram que a mesma é biologicamente ativa em macrófagos com pico mais elevado da atividade biológica no tempo de 1:30 h (46,5 U GBA/mg proteína) ou 30 min. (4 U GBA/mg proteína) em macrófago derivado de camundongo controle e camundongo com DG, respectivamente. Ensaios preliminares in vivo também foram investigados. A análise da atividade biológica da enzima GBA em baço, fígado e leucócitos após 1 hora da infusão de 19 U da enzima mutGBA permitiu mostrar um aumento de 1,4x, 1,5x e 1,8x, respectivamente, o que sugere a internalização da enzima mutGBA nesses tecidos. Por fim, foi possível realizar a clonagem celular e identificação de dois clones com maior produção de GBA em relação a população mista (p<0,05). O clone 5, com maior produção de mutGBA no sobrenadante, cerca de 301,4 (+ 4,35) U GBA/mL ou 207 (+ 3,23) U GBA /106 células e o clone 13, com maior produção de mutGBA intracelular, cerca de 622 (+ 4,35) U GBA/mg de proteína ou 325,5 (+ 3,23) U GBA/106 células Em conclusão, os dados apresentados mostram que a linhagem L16_293-FT-P2-mutGBA apresenta elevados níveis de produção de &beta;-glicosilceramidase recombinante, é capaz de ser internalizada por macrófagos e biologicamente ativa in vivo, sendo assim, uma linhagem de produção promissora para uso na TRE.