Aprimoramento das técnicas de edição genômica por CRISPR-Cas em zebrafish (Danio rerio) para investigação dos genes associados ao hipopituitarismo congênito revelados por sequenciamento de larga escala

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Fernandes, Bianca Helena Ventura
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: CRISPR/Cas systems; Edição de genes; Gene editing; Hipopituitarismo; Hypopituitarism; Sistemas CRISPR/cas; Zebrafish
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5135/tde-11092024-163142/

INTRODUÇÃO: O Zebrafish (Danio rerio) é um modelo animal essencial para os estudos em biologia e em medicina, permitindo uma ampla gama de pesquisas devido à sua semelhança genética com os humanos e suas características únicas, como a transparência embrionária e a rápida reprodução. Suas aplicações incluem estudos de desenvolvimento, formação de órgãos e regeneração de tecidos, além de ser um recurso valioso para triagens de drogas e técnicas de edição genômica como CRISPR-Cas. Estas técnicas têm sido amplamente utilizadas no modelo Zebrafish para investigar a função dos genes e explorar os mecanismos subjacentes às doenças humanas. Isso inclui a capacidade de realizar knockouts, knockins e knockdowns específicos em genes de interesse, abrindo novas perspectivas para compreender a fisiologia e a patologia desse modelo animal. Apesar de oferecer significativas vantagens, o modelo experimental do Zebrafish, apresenta desafios devido à rápida taxa de desenvolvimento embrionário, que demanda métodos de edição genômica eficientes e precisos em um curto espaço de tempo. Além de seu manejo e a sua manutenção exigirem habilidades técnicas especializadas para garantir resultados consistentes e reprodutíveis. Diante deste quadro, no presente estudo de doutoramento, investigaremos os mecanismos que levam ao hipopituitarismo congênito, utilizando o Zebrafish como modelo de pesquisa. Para isso, buscaremos aprimorar e desenvolver técnicas de edição genômica utilizando CRISPR-Cas para induzir alterações genéticas em genes associados ao hipopituitarismo congênito. O estudo do hipopituitarismo é desafiador e envolve a compreensão das bases moleculares das deficiências hormonais. Muito avançou-se em relação ao diagnóstico molecular dos pacientes com hipopituitarismo congênito com a utilização de sequenciamento em larga escala. Entre os estudos, destaca-se a dissertação de mestrado da Dra. Nathalia Ferreira, publicado em 2023 na revista Endocrine Connections, que teve como objetivo a busca de novos genes associados ao hipopituitarismo congênito em pacientes filhos de pais consanguíneos e sem diagnóstico molecular. Foram identificadas duas novas variantes alélicas nos genes GH1 e CDH2, nunca antes descritas. A alteração genética do GH1, levava a um frameshift e stop códon prematuro, gerando uma proteína truncada. Essa variante estava ausente em bancos de dados populacionais e foi associada ao quadro de deficiência de hormônio de crescimento (DGH) isolada (DGHI). A segunda variante foi identificada no gene CDH2, nunca antes associada ao hipopituitarismo congênito. Essa variante alélica foi prevista como provavelmente patogênica pelos critérios da ACMG e foi encontrada em uma paciente com deficiências de GH, TSH, ACTH, LF/FSH, associadas a uma neuro-hipófise ectópica e hipoplasia hipofisária. Estudos funcionais mostraram que essa variante afeta a agregação celular, possivelmente, influenciando o desenvolvimento da hipófise no mecanismo de transição epitélio mesenquimal. Para entender melhor o papel do gene CDH2, realizamos o knockout desse gene em zebrafish, que resultou em malformações graves e morte precoce da prole, impossibilitando a caracterização do animal knockout para o gene cdh2. OBJETIVOS: padronizar as técnicas de knockin e knockdown do gene cdh2 em zebrafish e correlacionar a função do cdh2 no desenvolvimento hipofisário. O segundo objetivo deste trabalho é explorar a viabilidade do animal com knockout no gene gh1, gene específico da hipófise, caracterizando os animais alterados genética, fenotípica e molecularmente. MÉTODOS: utilizamos a técnica de edição gênica por CRISPR Cas em zebrafish para manipular os genes cdh2 e gh1. Injetamos guias RNAs para o knockout do gene gh1 e empregamos técnicas de knockin e knockdown para o gene cdh2. Analisamos os fenótipos dos animais e avaliamos a expressão gênica por RTPCR e proteica por WB. RESULTADOS: O animal com knockout do gene gh1 resultou em infertilidade, aumento da mortalidade e tamanho reduzido. O knockin do gene cdh2 por edição de base mostrou baixa eficiência, enquanto o knockin por template doador não foi bem-sucedido. Os animais knockdown para cdh2 apresentaram fenótipos semelhantes aos animais knockout, porém com menor severidade. A expressão do hormônio de crescimento foi reduzida, sugerindo um papel importante do cdh2 na diferenciação hormonal terminal. CONCLUSÃO: Demonstramos a eficiência do knockout para o estudo do gene gh1, mimetizando as características humanas da doença. A técnicas de knockin, por edição de base ou por template doador, com o uso de drogas para facilitar a via de reparo por homologia direta e entrada do template, foram ineficazes para o gene cdh2, exigindo melhorias nessas abordagens. A redução da expressão de cdh2, com técnica de knockdown, causou redução da expressão proteica do hormônio do crescimento, destacando seu papel na diferenciação e secreção hormonal. Esses resultados fornecem conhecimentos importantes para a compreensão do hipopituitarismo e indicam a necessidade de aprimoramento das técnicas de edição gênica em zebrafish