Desenvolvimento e validação de ensaios in Desenvolvimento e validação de ensaios in vitro usando culturas de células imortalizadas e primárias para avaliação da eficácia fotoprotetora de protetores solares empregando como parâmetros de medida as alterações induzidas na pele pelas radiações UVA e UVB

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Figueiredo, Sônia Aparecida
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Cell culture techniques; Efficacy; Eficácia; in vitro methods; Métodos in vitro; Protetores solares; Radiação Ultravioleta; Sunscreens; Técnicas de Cultura de células; Ultraviolet radiation.
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60137/tde-03022017-145030/

A eficácia de protetores solares é determinada por métodos in vivo, que utilizam humanos, tais como: Fator de Proteção Solar (FPS), Immediate Pigment Darkening (IPD), Persistent Pigment Darkening (PPD) e Fator de Proteção UVA (FP-UVA). No entanto, esses parâmetros não refletem os efeitos danosos reais induzidos pela radiação solar sobre as estruturas e componentes celulares, como o DNA, lipídeos e proteínas. O objetivo deste estudo foi desenvolver ensaios in vitro com culturas de células para avaliar o potencial fotoprotetor de protetores solares empregando parâmetros biológicos que são alterados pela radiação UV. A primeira etapa deste estudo consistiu em selecionar a linhagem de células da pele (L929 ou HaCaT) que fornecesse a melhor relação entre dose de UVA ou UVB e o efeito danoso induzido. Este efeito foi quantificado pela medida da viabilidade celular, peroxidação lipídica e geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). O melhor modelo de cultura celular foi tratado com protetores solares de duas marcas diferentes com FPSs de 15 a 60, obtidos no mercado local. Amostras dos fotoprotetores foram aplicadas em uma placa de quartzo colocada no topo de uma microplaca preenchida por células. A viabilidade celular e a peroxidação lipídica, medidas em fibroblastos L929, foram os parâmetros mais promissores para avaliar a eficácia de protetores solares expostos à UVB e permitiram discriminar o potencial fotoprotetor de formulações com diferentes FPSs. Por outro lado, a formação de EROs, expressa em queratinócitos HaCaT, provou ser um parametro biológico promissor para discriminar a eficácia de protetores solares com diferentes FPSs ou FPSs/PPDs, expostos à UVA. Atualmente, as empresas estão adicionando aos protetores solares filtros orgânicos que absorvem na região do UVA, principalmente na faixa do UVA-1. Alguns pesquisadores têm demonstrado que o proteoma é o alvo para as EROs induzidas por UVA. Essas EROs diminuem a atividade da calcineurina (Cn), enzima conhecida pelo seu papel no recrutamento de células T. A liberação do ânion fosfato do substrato, pela ação da enzima, reduz com o aumento da exposição da Cn à radiação UVA-1. Desta forma, um método foi desenvolvido com células primárias HDFn para a avaliação da eficácia fotoprotetora de protetores solares na faixa de UVA-1, empregando a medida da atividade da Cn. Os resultados mostraram que a redução da atividade da Cn só foi proporcional a dose de UVA-1 quando o homogeneizado de células HDFn, contendo 417,55 ± 8,79 ?g/mL de proteínas, foi exposto a diferentes doses de UVA-1. Quando as culturas de células foram irradiadas por diferentes doses de UVA-1, não foi observado diminuição da atividade da enzima. Em adição, para maior precisão na medida da atividade enzimática, os homogeneizados, expostos ou não à luz UVA-1 e protegidos ou não por diferentes protetores solares, tiveram que ser diluídos na proporção de 1:2 em tampão ensaio 2x (1:1, v/v), antes da quantificação do fosfato por verde de malaquita. A medida da atividade da Cn mostrou ser um ensaio eficiente para diferenciar fotoprotetores adicionados de filtros orgânicos específicos para faixa de UVA-1 (marca B) daqueles não adicionados desses filtros (marca A). Como também, o ensaio foi capaz de diferenciar os protetores solares da marca B, com diferentes valores de PPD: fotoprotetor com PPD-15 não foi capaz de evitar a redução da atividade enzimática, semelhante ao homogeneizado exposto à luz UVA-1 sem proteção, mas diferenciou dos demais PPDs; PPDs 25 e 41 protegeram a atividade da Cn em 34,53 ± 4,15% e 38,19 ± 5,50%, respectivamente. Assim, os parâmetros biológicos testados neste estudo podem atuar como alternativas complementares para avaliação da eficácia de fotoprotetores.