Sistema repórter controlado pelo promotor de involucrina como ferramenta para monitorar a diferenciação de células epidérmicas

• Ano de defesa: 2021
• Autor(a) principal: Fernandes, Myrian Thiago Pruschinski
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: células-tronco mesenquimais; diferenciação de queratinócitos; gene repórter; involucrin promoter; keratinocytes differentiation; mesenchymal stem cells; modelo de pele; promotor de involucrina; reporter gene; skin model
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-29042022-112018/

A epiderme é um epitélio estratificado composto por várias camadas de queratinócitos, cuja função e homeostasia dependem da adequada proliferação e diferenciação dessas células. Diferentes abordagens são exploradas para o estudo da pele, como as células-tronco, também empregadas em aplicações terapêuticas nesse órgão. As células-tronco mesenquimais (CTM) do cordão umbilical têm se mostrado seguras, de fácil obtenção e multipotentes. No entanto, sua transdiferenciação em queratinócitos permanece um desafio, sendo essencial uma estratégia simplificada para monitorar, em tempo real e in situ, a diferenciação dessas células. Considerando que a involucrina é uma proteína marcadora da diferenciação terminal epidérmica, seu promotor (pINV) oferece expressão estrato-específica, sendo eficiente para acessar a diferenciação dos queratinócitos. O objetivo deste trabalho foi construir um vetor com um gene repórter sob controle do pINV para monitorar a transdiferenciação de CTM do cordão umbilical em queratinócitos in vitro. A sequência mínima do pINV foi amplificada por reação em cadeia da polimerase (PCR) e inserida no vetor lentiviral LeGO-G/NeoOpt, a montante do gene repórter EGFP (do inglês, enhanced green fluorescence protein) , originando LeGO-GpINV. As CTM e células HaCaT (controle positivo) foram transduzidas com os estoques lentivirais, produzidos em células HEK 293T. A expressão de EGFP nas células transduzidas foi analisada por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência em diferentes períodos de diferenciação. As CTM foram transdiferenciadas em queratinócitos pelo cultivo em meio de diferenciação KSFM (do inglês, Keratinocyte Serum Free Medium) com cálcio 1,8 mM e suplemento com EGF 5 ng/ml. A diferenciação de CTM foi acompanhada por alterações morfológicas e expressão de proteínas marcadoras da diferenciação epidérmica. A atividade das calicreínas teciduais (hK) 5, 6 e 7 foi detectada, em diferentes períodos, utilizando-se substratos fluorogênicos. A expressão de involucrina e citoqueratinas (CQ) 10 e 14 foi avaliada por citometria de fluxo. Ainda, a expressão de involucrina e filagrina foi avaliada por RT-qPCR e involucrina por western blot. Nas CTM transduzidas com LeGO-GpINV, houve aumento na expressão de EGFP nos dias 7 e 14 de diferenciação. Nas HaCaT, cerca de 75% das células expressaram EGFP e, após seleção com antibiótico específico, a expressão foi verificada em 95% das células. Em termos da diferenciação das CTM, após 14 dias, mais de 85% da população expressou involucrina, CQ 10 e 14 e houve aumento na expressão de involucrina e filagrina no dia 7 de diferenciação. A expressão dessas proteínas foi confirmada em células HaCaT. Houve um aumento na atividade de hK5, 6 e 7 após o sétimo dia de cultivo em meio de diferenciação, em comparação às células cultivadas em DMEM (meio de proliferação). Tal atividade foi acompanhada por alterações morfológicas típicas de queratinócitos. A ferramenta permitiu acessar a diferenciação de células epidérmicas temporalmente, preservando-se as culturas durante todo o processo. Esse sistema repórter abre perspectivas para melhor monitoramento da diferenciação das CTM em queratinócitos, possibilitando seu uso tanto em modelos de pele in vitro quanto in vivo, o que poderá fundamentar sua aplicação na medicina regenerativa.