Consequências moleculares de mutações em DNA2 em células de pacientes com síndrome de Rothmund-Thomson

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Silva, Tiago José da
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: 53BP1-NB; DNA2; Estresse replicativo; Homologous recombination; Recombinação homóloga; Replicative stress; Rothmund-Thomson syndrome; Síndrome de Rothmund-Thomson
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-16102024-131448/

Mutações em genes envolvidos na resposta celular ao estresse replicativo estão relacionadas a doenças genéticas raras, como a síndrome de Rothmund-Thomson (RTS), que se caracteriza por erupções cutâneas características denominadas poiquilodermia, baixa estatura, cabelos ralos, anomalias esqueléticas e um risco aumentado de desenvolver osteossarcoma e câncer de pele. Embora variantes patogênicas nos genes ANAPC1 ou RECQL4 estejam associadas à maioria dos casos de RTS, elas não estão presentes em todos os pacientes diagnosticados. O sequenciamento completo do genoma em células de pacientes sem mutações em RECQL4 ou ANAPC1 revelou mutações em heterozigose compostas no gene DNA2 previamente não associado ao RTS. Assim, nosso objetivo foi confirmar a patogenicidade dessas variantes e avaliar as consequências moleculares de mutações nesse gene no reparo e replicação do DNA. Os resultados do western blotting revelaram que os fibroblastos de um paciente apresentaram níveis baixos da proteína DNA2 em comparação com os fibroblastos controle. Padronizamos um método para pré-extrair proteínas não associadas à cromatina e estabelecemos um ensaio de imunofluorescência celular. Isso permitiu detectar o RPA associado ao DNA de fita simples formado durante o processo de ressecção e constatar que a linhagem celular do paciente com deficiência de DNA2 apresentava uma capacidade reduzida de reparar quebras de fita dupla pela da via de recombinação homóloga. Também por imunofluorescência, verificamos que a inibição química das DNA polimerases pela afidicolina induziu a presença de corpos nucleares de 53BP1 (53BP1-NB) em células RPE1-hTERT siNT que se acumularam na fase G1 do ciclo celular. Surpreendentemente, a depleção de ANAPC1, RECQL4 ou DNA2 em células RPE1-hTERT induziu a formação 53BP1-NB, mesmo sem o tratamento com afidicolina e esse acúmulo ocorreu principalmente na fase G2 do ciclo celular. Nossas descobertas indicam que as variantes no gene DNA2, anteriormente não associadas à RTS, são de fato patogênicas, levando à redução da expressão da proteína codificada e resultando em defeitos nos processos de reparo e replicação do DNA. Estudos adicionais serão necessário para investigar como esses defeitos podem contribuir para a apresentação clínica compartilhada entre os pacientes RTS.