Expressão da L-asparaginase II de Saccharomyces cerevisiae recombinante extracelular com glicosilação humanizada em Pichia pastoris

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Biasoto, Henrique Pellin
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Acute lymphoid leukemia; Asparaginase; Enzyme purification; Expressão extracelular; Extracellular expression; Leucemia linfoide aguda; Pichia pastoris; Proteína recombinante; Purificação enzimática; Recombinant protein; Saccharomyces cerevisiae
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-02102019-150712/

L-asparaginase é um inibidor eficiente do crescimento tumoral, usado em sessões de quimioterapia contra a Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA), resultando na remissão completa da doença em 90% dos pacientes tratados. A L-asparaginase II de Saccharomyces cerevisiae (ScASNaseII) tem alto potencial de superar os efeitos adversos da L-asparaginase de bactéria, porém sua produção endógena resulta em uma proteína hipermanosilada e, consequentemente, imunogênica. A cepa de Pichia pastoris Glycoswitch tem a maquinaria para expressar e secretar altas quantidades de enzima com glicosilação humanizada. Nesse trabalho, descrevemos o processo genético para expressar a ScASNaseII no meio extracelular pela P. pastoris Glycoswitch, e também os parâmetros bioquímicos, perfil cinético, citotoxicidade contra células leucêmicas e a interferência da glicosilação na atividade da enzima obtida. Nossos dados mostram que a cepa aplicada foi capaz de expressar ScASNaseII no meio extracelular passível de purificação de proteínas contaminantes com apenas um passo cromatográfico. A atividade específica para asparagina foi 218,2 UI/mg e a atividade glutaminásica representou 3,1% da atividade asparaginásica. Os parâmetros cinéticos foram KM = 120,5 µM e a eficiência catalítica de 3,8 x 105 M-1s-1. Análises por meio de gel nativo sugerem uma conformação tetramérica de aproximadamente 150 kDa. Essa é uma nova estratégia de produzir essa enzima de forma extracelular, com mais facilidade de purificação e com melhores propriedades biotecnológicas.