Detalhes bibliográficos
| Ano de defesa: |
2016 |
| Autor(a) principal: |
Pillaca Pullo, Omar Santiago |
| Orientador(a): |
Não Informado pela instituição |
| Banca de defesa: |
Não Informado pela instituição |
| Tipo de documento: |
Dissertação
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| Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
| Idioma: |
por |
| Instituição de defesa: |
Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
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| Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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| Departamento: |
Não Informado pela instituição
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| País: |
Não Informado pela instituição
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| Palavras-chave em Português: |
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| Link de acesso: |
http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-08112016-120926/
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Resumo: |
A enzima L-asparaginase (ASNase) usada como biofármaco no tratamento de Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) é de origem bacteriana, o que provoca reações imunológicas nos paciente e a ASNase usada no Brasil é importada o que dificulta seu uso por razões de abastecimento e de preço. Por outra parte, dentro dos sistemas de expressão de proteínas recombinantes usados pela biotecnologia, destaca-se a Pichia pastoris, levedura metilotrófica de fácil manipulação, crescimento rápido, alta capacidade de expressão e capaz de realizar modificações pós-traducionais. Neste projeto, o gene de ASNase II de Saccharomyces cerevisiae foi expressa em P. pastoris (Muts), tendo sido analisada a localização da enzima nos meios extracelular, intracelular e espaço periplasmático. Além disso, foram avaliadas diversas condições de crescimento e indução da ASNase em agitador orbital e finalmente foi feito o cultivo em biorreator de 3L operado em batelada. Segundo o analise da expressão, a enzima foi localizada no espaço periplasmático. O crescimento de P. pastoris em diferentes concentrações de glicerol (10,0 - 50,0 g.L-1) mostraram parâmetros cinéticos similares (µmáx = 0,35 h-1; tg= 2,0 h) e o maior fator de conversão de substrato em células (Y x/s = 0,9 g g-1) foi obtido com 10,0 g.L-1 de glicerol. A expressão de ASNase somente ocorreu a 20 °C e melhora com concentrações de metanol acima de 1,0% (v/v), obtendo-se a maior produção da enzima a 3% de metanol durante 48 horas, o que foi corroborado pelo planejamento fatorial fraccionado (3n-k + 2), n = 3 e k =1. Também se observou que o pH de indução, a suplementação com aminoácidos ou casaminoácidos e concentração de glicerol durante a fase de crescimento apresentaram pouca ou nenhuma influência na expressão. Entretanto, as células induzidas imediatamente após o glicerol ter sido consumido melhoraram a produção de ASNase. No cultivo em biorreator, a fase de crescimento foi feita com 10,0 e 40,0 g.L-1-1 de glicerol, e a fase de indução com pulsos de 3,0% (v/v) de metanol durante 120 horas. A maior atividade volumétrica (710,2 U.L-1) de ASNase foi obtida na batelada com 40,0 g.L-1 de glicerol e a atividade periplasmática foi constante durante o tempo de cultivo o que significa que o controle do pH afeta positivamente na expressão de ASNase. |
