Avaliação de técnicas miniaturizadas de preparação de amostras em estudos estereosseletivos de biotransformação e metabolismo in vitro

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Bocato, Mariana Zuccherato
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Microextraction techniques; Enantioselective in vitro metabolism studies; Técnicas de microextração; Estudos enantiosseletivos de metabolismo in vitro
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60137/tde-01112016-104713/

microssomas hepático de humanos (HLMs) e biotransformação empregando fungos. Anteriormente aos estudos de biotransformação e metabolismo in vitro, todos os métodos propostos foram validados e os resultados corroboraram de acordo com os guiais oficiais. Inicialmente foi desenvolvido um método para determinação simultânea da OXC e os enantiômeros de seu metabólito em meio de cultura empregando a eletroforese capilar. A separação foi realizada utilizando como eletrólito de análise uma mistura da ?-ciclodextrina fosfatada (P-?-CD) 1% (m/v) como seletor quiral em solução tampão tris-fosfato 10 mmol L-1 pH 2,5. O comprimento efetivo do capilar foi 20 cm, a tensão aplicada foi de ?20 kV e a temperatura de análise foi de 15° C. Para esse método, nenhuma técnica miniaturizada de preparação de amostra foi efetiva na extração desses analitos do meio de cultura. Portanto, optou-se por utilizar extração líquidolíquido empregando metil-terc-butil éter como solvente extrator. Os estudos de biotransformação demonstraram enantiosseletividade na formação da licarbazepina (LIC) a partir da OXC para duas espécies de fungos. A espécie Glomerella cingulata (VA1), biotransformou com 100% de fração enantiomérica (fe) o enantiômero (S)-(+)- LIC enquanto que a espécie Beuveria bassiana (ATCC 7159) metabolizou com fe de 79% o enantiômero (S)-(+)-LIC. Um outro método empregando a eletroforese capilar também foi desenvolvido neste trabalho. Este novo método foi empregado para a análise enantiosseletiva dos metabólitos da diHTBZ após o procedimento de metabolismo in vitro empregando microssomas hepático de humanos para o fármaco TBZ e também foi utilizado para análise dos metabólitos diHTBZ após o procedimento de biotransformação da TBZ empregando fungos. Neste método de EC foi utilizada como eletrólito de análise a carboximetil-?-ciclodextrina (CM-?-CD) 1% (m/v) como seletor quiral adicionada em solução tampão tris-fosfato 80 mmol L-1 pH 2,5. O comprimento efetivo do capilar correspondeu a 20 cm e a tensão aplicada foi de +15 kV. A temperatura de análise foi de 15° C. Entre as técnicas miniaturizadas de preparação de amostras avaliadas para extração destes metabólitos diHTBZ tanto em meio microssomal quanto em meio de cultura líquido, a DLLME foi escolhida. Para tanto, utilizando a matriz de meio microssomal (para aplicação dos estudos de metabolismo in vitro da TBZ) foi empregado 75 ?L de diclorometano como solvente extrator e 150 ?L de acetona como solvente dispersor. Os estudos de metabolismo in vitro demonstraram que o perfil cinético do metabolismo da TBZ corresponde a um comportamento de inibição pelo substrato e trata-se de um metabolismo diastereo- e enantiosseletivo. Estes estudos também demonstraram que os enantiômeros dos diastereoisômeros diHTBZ foram catalisados principalmente pela CYP2C19 e o clearance predito sugere que o metabolismo pelo fígado é a principal via para a eliminação da TBZ. Já, nos estudos de biotransformação com fungos para a TBZ, o método por CE foi utilizado e, assim como para o meio microssomal, as técnicas de microextração foram avaliadas. Novamente, foi escolhida a técnica DLLME como técnica de extração, e também foi utilizado 75 ?L de diclorometano como solvente extrator e 150 ?L de acetona como solvente dispersor. Os estudos preliminares de biotransformação da TBZ demonstraram diastereoisomerismo para todos os fungos avaliados, e, adicionalmente, para algumas espécies de fungos, houve também enantiosseletividade na formação dos isômeros. O fungo Chaetomiun globusum (VR10) metabolizou ambos isômeros da diHTBZ, sendo que a produção dos metabólitos foi diastereosseletiva para a formação majoritária do estereoisômero trans-diHTBZ e enantiosseletividade somente na produção do estereoisômero cisdiHTBZ. As espécies Glomerella cingulata (VA1), Mucor rouxii, e Beuveria bassiana (ATCC 7159), metabolizaram diastereoisomericamente e também enantiosseletivamente ambos metabólitos da diHTBZ, sendo que o fungo da espécie Mucor rouxii apresentou um perfil de metabolização bem interessante, com a formação majoritária dos enantiômeros (E1) dos diastereoisômeros cis- e trans- e formação majoritária do metabólito trans-diHTBZ. Os resultados apresentados nesse trabalho demonstraram que somente a DLLME foi efetiva na extração da TBZ em meio microssomal e em meio de cultura. Para analitos com características bastante básicas, como é o caso da OXC, as demais técnicas de microextração avaliadas não foram eficientes nas condições de análise empregadas nesse estudo devido principalmente à dificuldade de manter estes analitos na forma molecular. Porém, a importância deste trabalho recai sobre os resultados obtidos a partir da aplicação dos estudos estereosseletivos de biotransformação com fungos de ambos os fármacos e, principalmente, nos resultados obtidos do metabolismo in vitro da TBZ que corroboram com dados in vivo da literatura e traz novas informações a respeito do metabolismo deste fármaco