Detalhes bibliográficos
| Ano de defesa: |
2022 |
| Autor(a) principal: |
Costa, Hernan Hermes Monteiro da |
| Orientador(a): |
Não Informado pela instituição |
| Banca de defesa: |
Não Informado pela instituição |
| Tipo de documento: |
Dissertação
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| Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
| Idioma: |
por |
| Instituição de defesa: |
Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
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| Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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| Departamento: |
Não Informado pela instituição
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| País: |
Não Informado pela instituição
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| Palavras-chave em Português: |
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| Link de acesso: |
https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-24102023-112317/
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Resumo: |
O vírus Zika (ZIKV) é um arbovírus emergente da família Flaviviridae, e um problema atual em todo o mundo, principalmente devido às síndromes congênitas e neurológicas associadas a ele. Como os sintomas clínicos iniciais das doenças causadas pelos flavivírus são muito semelhantes, o diagnóstico clínico é difícil. Ainda, há grande complexidade em obter testes diagnósticos específicos e sensíveis, devido à alta similaridade antigênica entre estes arbovírus, e o tratamento por meio de imunoterapias representa um grande desafio, e ainda não foram alcançados. Sendo assim, esforços para a obtenção e avaliação de insumos como possíveis candidatos ao desenvolvimento de testes rápidos ou para uma imunoterapia se fazem necessários. Nesse trabalho, foi realizado a expressão, purificação e caracterização da proteína de envelope recombinante de ZIKV (rEZIKV) e quatro anticorpos recombinantes humanos do tipo scFv (single chain variable fragment) com especificidade ao ZIKV. Previamente, foi realizado três estratégias de biosseleções por Phage Display pelo nosso grupo, a partir do uso de bibliotecas de anticorpos recombinantes Fab expressos em fagos filamentosos, possibilitando a obtenção de milhares de sequências distintas por meio do sequenciamento de próxima geração (NGS) das regiões variáveis das cadeias leves e pesadas de anticorpos. Na primeira estratégia, foi realizado a seleção diretamente contra ZIKV, sem pré-adsorção contra outro flavivírus. Na segunda e terceira estratégia, as sequências foram selecionadas por meio de uma abordagem subtrativa de seleção negativa e positiva contra vírus Dengue sorotipo 2 (DENV2) e ZIKV, respectivamente. Inicialmente foi realizado a expressão da proteína rEZIKV em E. coli a fim de produzir antígenos para a validação dos anticorpos monoclonais. Foi utilizado um biorreator Airlift com volume de 5 L e purificação em coluna de níquel em um sistema automatizado de cromatografia. A proteína rEZIKV teve rendimento de 20mg/L e manteve sua antigenicidade e imunogenicidade. Posteriormente, com base em análises do programa ATTILA, usando como parâmetro de escolha o enriquecimento das sequências após cinco ciclos de biosseleção, foram escolhidas quatro sequencias de scFvs anti-ZIKV. As sequencias gênicas foram sintetizadas e clonadas em vetor pET-SUMO e expressadas em sistema heterólogo de células bacterianas, purificados por afinidade em um sistema de cromatografia automatizado. Foi demonstrado que os quatro scFvs se ligam à proteína rEZIKV e às partículas maduras de ZIKV tanto por ELISA quanto por western blot. Ainda, outros quatro scFvs anti-ZIKV da segunda e terceira estratégia foram selecionados pelo programa ATTILA, sintetizados e clonados em vetor pCOd600, que contém a sequência Fc de IgG1 humana, gerando um anticorpo no formato FvFc. Desta forma, avançamos na criação e caracterização de um banco de anticorpos monoclonais recombinantes a fim de estabelecer estratégias para o desenvolvimento de diagnóstico diferencial ou mesmo imunoterapias para o tratamento de infecções geradas pelo ZIKV. Os novos insumos gerados neste trabalho parecem ser promissores e novos ensaios serão realizados a fim de avaliar a viabilidade para sua utilização no manejo de infecções por ZIKV. |
