Anticorpo monoclonal humanizado ANTI-CD3: obtenção e caracterização físico-química e funcional com avaliação do perfil imunorregulatório

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Carvalho, João Victor Batalha de
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Anti-CD3; Citocinas; Citometria de fluxo; Cytokines; Flow cytometry; Humanização; Humanization; Tolerance; Tolerância; Treg
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/42/42133/tde-15022023-170355/

O CD3 é um conjunto de cadeias proteicas não-covalentemente associadas às cadeias do receptor das células T (TCR). O complexo CD3 é essencial para a ativação dos linfócitos T e até para a correta expressão do seu TCR na superfície celular. O complexo TCR-CD3 é alvo de várias imunoterapias focadas na regulação da atividade dessas células. Anticorpos monoclonais (mAbs) anti-CD3 possuem grande potencial no tratamento de doenças autoimunes (diabetes mellitus I, doenças inflamatórias do intestino), na indução de tolerância em transplantes alogênicos e na imunoterapia oncológica (anticorpos bi-específicos). O mAb anti-CD3 produzido por hibridoma murino possui limitações de uso terapêutico pela indução de reações adversas como proliferação de células T e secreção de citocinas pró-inflamatórias. Para evitar problemas associados à imunogenicidade das moléculas não-humanas, alguns mAbs anti-CD3 passaram por humanização. como o Otelixizumab, Visilizumab, Teplizumab. O uso experimental de mAbs anti-CD3 humanizados tem sido associado a um aumento de linfócitos T reguladores (Treg) e de citocinas relacionadas com um perfil imunorregulador. Para testar o potencial imunorregulador de um anti-CD3 humanizado a partir de um hibridoma reclonado no Instituto Butantan, este trabalho propõe a avaliação da atividade imunorreguladora induzida por mAbs anti-CD3 humanizados através de ensaios in vitro. Os genes das cadeias leve e pesada da molécula humanizada in silico foram clonados em vetor pCHO e transfectados em células CHO-S. Os clones foram avaliados pela produtividade, crescimento celular e ligação ao CD3 humano. Para os ensaios de ligação por ressonância plasmônica de superfície (SPR) foi expresso um antígeno humano CD3 gama-épsilon. O gene do antígeno recombinante foi construído por DNA assembly e expresso em Escherichia coli. O perfil de ligação dos anticorpos humanizados é mais baixo do que aquele visto com o anti-CD3 murino, o que indica uma menor afinidade da molécula humanizada. Dos 280 clones de anti-CD3 umanizado, foram selecionados alguns para os ensaios funcionais in vitro com PBMC humano, além do pool estável pré-clonagem. Por citometria de fluxo a taxa de proliferação de dois clones avaliados foi mais baixa do que a induzida por tratamento com o anti-CD3 murino em ambas as concentrações testadas (1 e 5 g/mL). O tratamento com o anticorpo humanizado aumentou a subpopulação de células T CD4&#43 e diminuiu o CD8&#43 em relação ao murino. A subpopulação de Treg (CD4&#43 CD127-CD25highFoxp3&#43 ) aumentou com o tratamento humanizado, ao inverso do mesmo com o anticorpo murino. O perfil de citocinas/quimiocinas (48h/192h) para o tratamento com o anti-CD3 murino foi altamente inflamatório no tempo de 48h na avaliação do sobrenadante e nos tempos de 24 e 72 h no ensaio de marcação intracelular. Os clones humanizados presentaram um perfil próximo ao controle não tratado na avaliação dessas citocinas. Entretanto, o estudo das citocinas intracelulares apresentou um aumento dos granulócitos nos grupos tratados com o anticorpo humanizado, sendo que esses grupos não apresentaram um aumento na produção de IFN-&#947 e TNF-&#945. Estes dados contribuem para a compreensão da cinética do anti-CD3 humanizado, apesar de não conclusivos. Mais estudos são necessários nas possíveis construções do anti-CD3 humanizado (monoespecíficos, biespecíficos etc.).