Detalhes bibliográficos
| Ano de defesa: |
1998 |
| Autor(a) principal: |
Falco, Maria Cristina |
| Orientador(a): |
Não Informado pela instituição |
| Banca de defesa: |
Não Informado pela instituição |
| Tipo de documento: |
Tese
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| Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
| Idioma: |
por |
| Instituição de defesa: |
Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
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| Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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| Departamento: |
Não Informado pela instituição
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| País: |
Não Informado pela instituição
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| Palavras-chave em Português: |
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| Link de acesso: |
https://teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-20210104-183430/
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Resumo: |
Estabeleceu-se um sistema de transformação de plantas a partir de biolística em calos embriogênicos de dois clones nacionais de cana-de-açúcar, SP80-180 e SP82-3721. Após experimento para obtenção de quantidade suficiente de calos embriogênicos derivados de segmentos transversais de folhas jovens, foram otimizados parâmetros como distância do alvo, pressão de disparo e quantidade de DNA, em aparelho de biolística desenvolvido pelo Centro de Tecnologia Copersucar, segundo modelo descrito por FINER et.al.(1992). Para isso, calos embriogênicos foram bombardeados com o vetor pAhc27, que contém o gene repórter uid-A (gus). Análises histoquímicas com o substrato X-gluc foram realizadas para determinação dos melhores níveis de expressão. Microscopia ótica e eletrônica de varredura foram realizadas para melhor compreender a introdução das partículas nas células. Calos embriogênicos em fase R2 (resultantes de dois ciclos de seleção) foram utilizados para determinar a sensibilidade do explante ao antibiótico geneticina, que seria utilizado em meio seletivo para seleção dos transformantes. Vários experimentos de co-transformação, utilizando os plasmídios pHA9 (que contém o gene de resistência a antibióticos aminiglicosídicos, como kanamicina e geneticina) e pAHC20 (que contém o gene de resistência ao herbicida glufosinato de amônio), foram realizados com os dois clones. Após seleção de calos transformados e regeneração de plantas em meio seletivo contendo geneticina (30 mg/L),|as possíveis plantas transgênicas foram transferidas para casa de vegetação. Teste fenotípico para resistência ao antibiótico foi realizado em casas de vegetação, com aplicação do antibiótico kanamicina (1%) diretamente sobre ferimento em limbo foliar. O herbicida comercial Finale foi aplicado em duas pulverizações sobre as plantas que se mostraram resistentes ao antibiótico. As plantas resistentes foram consideradas co-transformadas. Parte das plantas co-transformadas foram submetidas a análises moleculares para confirmação da co-transformação. Hibridizações Southern foram realizadas para detectar a presença dos genes no genoma e estimar o número de cópias inseridas. Também foram analisadas plantas obtidas por micropropagação das plantas transformadas para verificar a manutenção do status transgênico. Análises de expressão dos transgenes foram realizadas por dois métodos diferentes: imunoensaio Western blot para proteína NPT-II, e RT-PCR para RNA transcrito do gene bar. O presente sistema possibilitou a obtenção de plantas transformadas de cana-de-açúcar em cerca de 200 dias e provavelmente será adaptável para introdução de outros genes de interesse agronômico que já estão sendo estudados para a cultura |
