Construção de ferramentas moleculares para estudo in vitro da função do receptor de succinato (GPR91)

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Santos, Andressa Mayara dos
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: BRET; Dor; GPCR; GPR91; Pain; Succinate; Succinato; TANGO
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17133/tde-26092024-135000/

O succinato, intermediário do Ciclo de Krebs, está envolvido em diversas rotas metabólicas e é um importante componente para a regulação da homeostase energética. Seu receptor - GPR91 (Sucnr1) - desempenha papel fundamental na detecção de desbalanços causados por estresse local, neste contexto, resultados preliminares do nosso grupo demonstraram que injeções de succinato e consequente ativação do receptor GPR91 em camundongos wild-type contribuíram para o desenvolvimento de hipersensibilidade mecânica (alodinia). Com esse background, visamos desenvolver uma ferramenta in vitro baseada na técnica TANGO (ativação transcricional mediante translocação de beta arrestina) e BRET (transferência de energia de ressonância de bioluminescência) para o estudo funcional de GPR91. Para a realização de experimentos por BRET, inserimos o fragmento do receptor GPR91 associado ao fator de transcrição tTA no vetor pcDNA3.1/Hygro(+)-GFP10-RLucII a fim de associar a luciferase RLucII a porção c-terminal do receptor. Após validação da inserção, GPR91-RLucII e GFP-NLS foram transfectados em diferentes concentrações a fim de encontrar as condições ideais para realização dos experimentos de BRET. Outra abordagem, seria induzir a expressão estável do receptor GPR91-TANGO em células HTLA utilizando duas estratégias: o kit Kit Flp-In T-Rex (Invitrogen) e a transdução lentiviral. Em relação a abordagem por lentivírus, inicialmente tentamos realizar a clonagem do inserto GPR91-TANGO no vetor lentiCas9-EGFP. Entretanto, possivelmente devido a estratégia de clonagem e/ou inserção de eventuais mutações no backbone, não obtivemos sucesso na produção de partículas virais. Um vetor Lenti GPR91-TANGO já clonado com nosso receptor de interesse foi encomendado, transfectado em células HEK Phoenix para produção de partículas virais e posteriormente transduzido em células HTLA. As células com marcação positiva para a proteína fluorescente GFP se encontram em processo de isolamento e expansão clonal. A partir das técnicas propostas no presente projeto esperamos disponibilizar novas ferramentas e realizar screening em larga escala de moléculas moduladoras do receptor GPR91 com potencial terapêutico de modo rápido e eficaz.