Detalhes bibliográficos
| Ano de defesa: |
2020 |
| Autor(a) principal: |
Pomatay, Luis Alberto Quispe |
| Orientador(a): |
Não Informado pela instituição |
| Banca de defesa: |
Não Informado pela instituição |
| Tipo de documento: |
Dissertação
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| Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
| Idioma: |
por |
| Instituição de defesa: |
Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
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| Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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| Departamento: |
Não Informado pela instituição
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| País: |
Não Informado pela instituição
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| Palavras-chave em Português: |
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| Link de acesso: |
https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-21092023-085334/
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Resumo: |
Nas últimas décadas, observou-se uma melhoria de várias etapas do processo de fabricação de produtos biofarmacêuticos, que acabaram se traduzindo em aumento da capacidade de produção do setor. No entanto, a produção de produtos biofarmacêuticos envolve processos complexos e de baixo rendimento. Entre os principais fatores limitantes relacionados ao estabelecimento de uma plataforma de produção baseada em células de mamíferos estão o tempo prolongado e altos custos associados ao processo de obtenção de clones celulares de alta produtividade. Essas limitações estão intimamente relacionadas às metodologias comumente empregadas para a geração de transfectantes celulares estáveis, que envolvem eventos aleatórios de integração genômica de vetores de expressão, e o uso de protocolos de amplificação gênica, que estão associados, respectivamente, a eventos de inserção em sítios cromossômicos com atividade transcricional instável e reordenamentos genéticos drásticos. Uma alternativa que tem sido explorada nos últimos anos é baseada na inserção sítio-dirigida do cassete de expressão de interesse em regiões do genoma da célula hospedeira previamente associadas à uma atividade transcricional elevada e estável. A indústria biofarmacêutica tem mostrado um crescente interesse por este tipo de alternativa para a geração de clones superprodutores em células CHO, uma das plataformas de expressão mais utilizadas para a produção de biofármacos. Nesse sentido, existe uma demanda para se acumular conhecimento sobre regiões genômicas que suportam níveis estáveis e elevados de expressão gênica, e o objetivo principal deste trabalho consistiu na varredura desses “hotspots” genômicos na linhagem celular CHO-DG44. Nossa estratégia experimental envolveu: a) a construção e o uso de um vetor lentiviral bicistrônico de expressão, o pLV-spEYFP-DHFR, para a varredura de sítios genômicos em células CHO-DG44 associadas a uma expressão elevada e estável da proteína de interesse, e b) o uso de uma variante secretada da EYFP, a spEYFP, como proteína repórter, com o intuito de evitar um possível efeito deletério associado ao acúmulo citoplasmático da EYFP. Alternativamente, as células CHO-DG44 foram transfectadas com o mesmo vetor de expressão com o objetivo de se isolar clones celulares para servir como referência de níveis de expressão da spEYFP associados a números mais elevados de cópias genômicas do vetor de expressão. Explorando-se a transdução das células CHO-DG44 com o vetor pLV-spEYFP-DHFR, foram isolados e caracterizados oito clones celulares associados a eventos de integração genômica únicos do vetor de expressão. Estes clones celulares apresentaram níveis de expressão estáveis da proteína repórter por até dois meses, e comparáveis aos observados em clones celulares contendo de 35 a 45 cópias do mesmo vetor de expressão aleatoriamente integrado no genoma das células CHO-DG44. As nossas tentativas de mapeamento dos sítios genômicos de inserção através da técnica de DNA “walking” foram dificultadas por várias limitações associadas a fatores que limitaram a sensibilidade da técnica em detectar eventos únicos de inserção. Este trabalho foi a primeira tentativa de mapear sítios genômicos transcricionalmente ativos e estáveis em células CHO-DG44, e buscou, desta forma, complementar os achados envolvendo outras linhagens de células CHO importantes, a CHO-K1 e a CHO-S. |
