Otimização de uma plataforma baseada na edição gênica por CRISPR/Cas9 para a produção de células T alogênicas expressando o receptor quimérico de antígeno (CAR)

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Lima, Sarah Caroline Gomes de
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Chimeric antigen receptor; CRISPR/Cas9; Inserção gênica direcionada; Knock-in; Knockout; Nocaute gênico; Receptor de antígeno quimérico; Receptor de células T; T cell receptor
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17153/tde-13052024-144054/

A terapia alogênica com células T expressando receptores quiméricos de antígeno (CARs) é uma estratégia promissora para aumentar a acessibilidade ao tratamento. Essa abordagem possui inúmeras vantagens, como a disponibilidade de um produto pronto para o uso, padronizado e com custo reduzido devido ao escalonamento da produção. No entanto, a implementação desta abordagem em larga escala suscita preocupação pelo desenvolvimento da doença do enxerto contra o hospedeiro, uma complicação potencialmente fatal causada pelo reconhecimento de aloantígenos pelo receptor de células T (TCR) dos linfócitos T-CAR. Uma solução para contornar este obstáculo é a depleção do TCR da superfície das células T-CAR por meio de ferramentas de edição gênica. Neste trabalho, foi descrito o processo de estabelecimento de uma plataforma de produção de células T-CAR anti-CD19 alogênicas baseada na depleção do TCR por nocaute ou inserção gênica direcionada utilizando CRISPR/Cas9. Primeiramente, avaliou-se a eficiência de dois RNAs guia (gRNAs) na depleção do TCR, tendo como alvo o gene codificante da região constante da cadeia α do TCR (TRAC). Foi utilizado um modelo de células T eletroporado com o plasmídeo codificante da Cas9 e identificado um gRNA capaz de gerar até 80% de células CD3-, sendo este escolhido para as etapas subsequentes. Para a estratégia de produção por nocaute gênico, células T foram transduzidas com partículas lentivirais para a expressão do CAR e eletroporadas para a entrega dos complexos riboucleoproteicos (RNPs) de Cas9 e gRNA. Foi observada uma maior eficiência de edição e recuperação celular quando a ativação celular precedeu a eletroporação. A eficiência de nocaute foi superior a 86%, sendo que ~39% das células apresentaram o fenótipo de interesse (CAR+CD3-). A viabilidade celular alcançou 75% após dois dias da transdução e permaneceu acima de 60% após a eletroporação. Comparadas às células T-CAR convencionais, as editadas mantiveram a citotoxicidade seletiva ao antígeno CD19 e apresentaram níveis aumentados de secreção de interferon-γ. Em seguida, redirecionamos a ferramenta CRISPR/Cas9 para a inserção dirigida (knock-in) do CAR e o nocaute do TCR em uma estratégia de etapa única, eliminando a necessidade do uso de vetores virais. O knock-in no locus TRAC foi feito através do fornecimento de um template de DNA de fita dupla, que foi entregue em conjunto com as RNPs via eletroporação, para direcionar o reparo por homologia. Observamos porcentagens elevadas de nocaute do TCR (~91,5%) e de knock-in do CAR (~83,7%) 5 dias após a eletroporação. O crescimento celular moderado foi um reflexo da queda na viabilidade, a qual correspondeu a 27% no dia 3 e ~60% no dia 7 de manufatura. Embora tenhamos confirmado a integração do transgene CAR no alvo por ensaio de PCR \"in-out\", observamos uma queda na frequência de células CAR+ em tempos de cultura prolongados. Apesar disso, nesse estágio, as células T-CAR editadas apresentaram atividade contra células tumorais alvo. Ainda que promissor, este protocolo requer otimizações. Por outro lado, a produção de células T-CAR editadas por nocaute gênico se mostrou uma metodologia robusta, permitindo a obtenção de uma elevada eficiência de edição e um rendimento celular satisfatório.