Geração de células NK-CAR anti-CD19 como uma alternativa alogênica para o tratamento de neoplasias de células B

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Silvestre, Renata Nacasaki
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: CAR-NK; Células natural killer; Chimeric antigen receptor; Genetic modifications; Immunotherapy; Imunoterapia; Modificações genéticas; Natural Killer cells; NK-CAR; Receptor quimérico de antígeno
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/17/17153/tde-08082022-094847/

Recentemente, a terapia de neoplasias hematológicas foi revolucionada pelo uso de células T autólogas que expressam receptores quiméricos de antígenos (CAR). Apesar desse sucesso, existem inúmeras vantagens para explorar também células CAR alogênicas, como as CAR-Natural Killer (NK-CAR). A capacidade de direcionar a citotoxicidade contra tumores refratários por meio da expressão de CAR em NK provavelmente contribuirá para uma mudança de paradigma no tratamento do câncer. Nossa hipótese é que novos construtos CAR que modulam as vias de IL-15 ou IL-27 podem promover aumentos significativos na proliferação, ativação e atividade citotóxica de células NK. Células NK de diferentes fontes (linhagem NK-92, sangue periférico e de cordão) foram modificadas geneticamente e analisadas por citometria de fluxo, por meio da marcação da região fab´ de CAR. As células NK-92 transduzidas foram selecionadas positivamente por coluna magnética. Células NK-CAR tiveram sua citotoxicidade avaliada por três metodologias: citometria de fluxo, Delfia Europium e Incucyte System. A eficiência in vivo das células NK-CAR foi avaliada em modelos murinos de neoplasia de células B, pela medição da carga tumoral por bioluminescência e curva de sobrevida. Inicialmente, exploramos o potencial dos promotores EF1&alpha; e SFFV para conduzir a expressão de CAR. O promotor SFFV produziu altos títulos lentivirais e alcançou a melhor eficácia de transdução em células NK. No vetor SEW-SFFV-CAR.19, clonamos as citocinas IL-15, IL-15/IL-15R&alpha; e IL-27. Células NK de diferentes fontes foram então modificadas com estes vetores e a porcentagem de NK-CAR foi mensurada por citometria de fluxo. Nossos resultados demonstraram uma baixa porcentagem de células expressando SEW-SFFV-CAR.19 (10,7%±1,93), SEW-SFFV-CAR.19-IL-15 (5,8%±3), SEW-SFFV-CAR.19-IL-15/IL-15R&alpha; (3,7%±1,1) e SEW-SFFV-CAR.19-IL-27 (3,2%±0,6) em células NK-92. As células NK-92-CAR foram selecionadas com anticorpo anti-CAR, o que proporcionou um aumento na pureza de células NK-CAR (>98% CAR+). Posteriormente, células NK-CAR foram co-cultivadas com células tumorais que expressavam CD19 ou não. O ensaio de citotoxicidade mostrou que células NK-92-CAR.19 (todos os constructos) foram mais citotóxicas contra células CD19+ quando comparadas com NK-92 wt (p<0,05). Células NK de sangue periférico (NK-PB) e de sangue de cordão (NK-CB) apresentaram taxas de eficiência média de transdução de 26,72% e 54,5%, respectivamente, entretanto essa expressão não foi estável. Apesar disso, ensaios citotóxicos demonstraram que células NK-PB-SFFV-CAR.19 e NK-CB-SFFV-CAR.19 foram mais citotóxicas contra células tumorais que expressam CD19 do que células NK não transduzidas (p<0,05). Na avaliação da eficiência antitumoral das células NK-92-CAR.19 in vivo não houve diminuição na carga tumoral entre os grupos controle e tratamentos até dia 14, porém no dia 21 notou-se uma menor carga tumoral no grupo tratado com células NK-92-SFFV-CAR.19-IL-15/IL-15R&alpha; (p<0,05), o qual também apresentou uma maior sobrevida (p<0,05). Portanto, nossos dados demonstram que é viável gerar células NK modificadas por CAR com atividade antitumoral potente e seletiva, mas ajustes no modelo animal ainda são necessários. Em resumo, esse projeto de pesquisa deu o passo inicial para a implementação da geração e produção de NK-CAR no Brasil. Os resultados deste projeto representam o início do desenvolvimento de uma plataforma off-the-shelf de células NK-CAR que poderá, num futuro próximo, ser utilizada na imunoterapia alogênica do câncer.