Isolamento e caracterização estrutural e funcional de neurotoxinas presentes nas frações XIIA e XIIB da peçonha do escorpião Tityus serrulatus

• Ano de defesa: 2015
• Autor(a) principal: Cremonez, Caroline Marroni
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: canais iônicos; Ionic Channels; Tityus serrulatus; Ts1-G; Ts11; Ts9
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60134/tde-29072015-113958/

O escorpião amarelo Tityus serrulatus (Ts) é considerado a espécie mais perigosa do Brasil, e muitas das toxinas de sua peçonha já foram isoladas e caracterizadas. No entanto, as frações XIIA e XIIB, obtidas da cromatografia de troca iônica da peçonha de Ts, possuem várias toxinas de baixa massa molecular ainda não caracterizadas. Através da combinação de técnicas de RP-FPLC em colunas C8 e C18, espectrometria de massas e/ou sequenciamento amino-terminal, foi possível isolar e identificar os componentes destas frações, bem como realizar as caracterizações estrutural, por RMN, e eletrofisiológica, por Two Microelectrode Voltage Clamp, de algumas neurotoxinas isoladas. Foram escolhidas três toxinas de interesse: Ts11, Ts9 e Ts1-G. Nossos resultados mostram que a Ts11 foi capaz de bloquear canais para potássio dependentes de voltagem (Kv): Kv1.2, Kv1.3, Kv4.2, Kv10.1, hERG, e Shaker IR, bloqueando em 25%, 27%, 25%, 15%, 12%, e 10% as correntes de potássio, respectivamente. A Ts11 possui uma estrutura única (estrutura obtida por RMN): ICK scaffold sem os elementos de estrutura secundária (alfa-hélice ou fita-beta). Esta estrutura diferenciada, somada à atividade biológica caracterizada neste estudo, evidencia uma nova subfamília de KTxs, a qual foi denominada como ?-KTx, sendo a Ts11 o primeiro membro desta subfamília: ?-KTx1.1. A caracterização funcional da Ts9 mostra que a mesma não apresenta atividade bloqueadora sobre os canais Kv testados (Kv1.1; Kv1.2; Kv1.3; Kv1.4; Kv1.5; Kv1.6; Kv2.1; Kv3.1; Kv4.2; Kv7.2; Kv10.1 hERG e Shaker IR), na concentração de 100 nM. Apesar da Ts9 não ter bloqueado os canais testados, ela apresenta estrutura e resíduoschave que sugerem sua ação em Kvs e estudo anteriormente publicado mostra que ela é um potente ligante de canais para potássio ativados por cálcio de baixa condutância (SK). Também foi conduzido um estudo comparativo entre a Ts1e sua isoforma precursora Ts1-G nos canais para sódio dependentes de voltagem Nav1.1 - 1.8 e DmNav1, a fim de analisar a importância da amidação C-terminal. A Ts1 madura possui região C-terminal amidada, enquanto que sua isoforma Ts1-G não é amidada, pois apresenta uma Gly na região Cterminal (última etapa de transformação pós-traducional, anterior a ação da enzima ?- amidante). A Ts1-G não apresentou ação nos canais (Nav) na concentração testada (100 nM), enquanto que a Ts1 (100 nM) age como ?- toxina, reduzindo o limiar de excitação dos canais Nav e/ou reduzindo as correntes de sódio, evidenciando que a amidação C-terminal é importante para a atividade biológica da toxina madura. Adicionalmente, nas análises por MALDI/TOF das frações XIIA e XIIB, foram encontrados 45 componentes cujas massas moleculares não correspondem a de toxinas já isoladas, abrindo perspectivas para a identificação de moléculas com potencial uso biotecnológico, visto que toxinas com ação em canais iônicos podem ser ferramentas valiosas para a elucidação das características farmacológicas, fisiológicas e estruturais dos seus alvos.