Clonagem, expressão e purificação de um domínio hipotético de ligação a ácidos graxos em Leishmania amazonensis para ensaios de biologia estrutural

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Athayde, Lucas Felipe Almeida
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Biologia Estrutural; Espectroscopia de RMN; FAB; FABP; NMR spectroscopy; Structural Biology; tripanosomatídeos; Trypanosomatids
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-11122023-162533/

As leishmanioses são uma classe de doenças tropicais negligenciadas causadas por diferentes espécies do gênero Leishmania, da família Trypanosomatidae. Durante o seu ciclo de vida, os parasitas desse gênero multiplicam-se em hospedeiros vertebrados e não-vertebrados, diferenciando-se formas celulares distintas: promastigotas e amastigotas. Esses parasitas capturam ácidos graxos do hospedeiro e os utilizam como fonte de energia ou como esqueletos para a construção de moléculas mais complexas. Dado a importância do metabolismo de ácidos graxos para a sobrevivência e multiplicação dos parasitas no hospedeiro, procurou-se no banco de dados genômicos de tripanosomatídeos, TriTrypDB, proteínas hipotéticas potencialmente semelhantes a proteínas de ligação de ácidos graxos eucarióticas (FABP). A proteína hipotética codificada pelo gene LmxM.34.3070 foi identificada pela primeira vez em Leishmania mexicana. Buscas no banco de dados TriTrypDB demonstraram que o gene LmxM.34.3070 é conservado em outros tripanosomatídeos. Diferentes métodos de predição foram utilizados para prever a estrutura da proteína LmxM.34.3070, revelando a presença de um domínio C-terminal estruturalmente semelhante a proteínas de ligação de ácidos graxos eucarióticas (FABP). Essas predições sugerem que a proteína completa, LmxM.34.3070, poderia estar associada ao metabolismo de lipídios e ácidos graxos, essencial para a sobrevivência do parasito no ambiente do hospedeiro. O objetivo principal deste trabalho foi obter amostras do domínio C-terminal de LmxM.34.3070 adequadas a estudos de biologia estrutural. Para isso, quatro construções foram desenhadas, clonadas e testadas quanto à expressão heteróloga, solubilidade, rendimento e estabilidade. A construção mais solúvel, LmxM.34.3070>sub>638-822 ou LeiFABP, foi caracterizada por espectroscopia de dicroísmo circular (CD), espalhamento de luz a múltiplos ângulos (MALS) e espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). As medidas de MALS mostraram que o domínio LeiFABP é monomérico. A análise quantitativa do espectro de CD indicou que 32% dos aminoácidos de LeiFABP assumem estrutura do tipo β, enquanto 15% assumem estrutura de α-hélice. O resultado desta análise é consistente com as predições em Colab Fold. O espectro de RMN de 1H apresentou boa dispersão na região dos HNs e linhas relativamente estreitas, sugerindo que a construção LeiFABP é adequada para a análise estrutural por RMN em solução ou cristalografia.