Caracterização molecular de isolados de Klebsiella pneumoniae resistentes às polimixinas

• Ano de defesa: 2020
• Autor(a) principal: Pancotto, Lisiane Rech
• Orientador(a): Barth, Afonso Luis
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Farmacorresistência bacteriana; Polimixinas; Klebsiella pneumoniae; Sequenciamento completo do genoma
• Palavras-chave em Inglês: Antimicrobial resistance; Polymyxin; mgrB
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/216888

Este estudo teve como objetivo realizar a caracterização molecular de isolados de Klebsiella penumoniae resistentes às polimixinas, com foco em alterações cromossomais. Um total de 35 isolados clínicos de K. pneumoniae resistentes aos carbapenêmicos e a polimixina B de 3 hospitais em Porto Alegre no período de abril de 2013 a agosto de 2015 foram incluídos no estudo. Todos os 35 isolados de K. pneumoniae apresentaram os genes pmrA, pmrB, pmrD, phoP e phoQ com o tamanho molecular esperado, indicando que nenhuma deleção ou inserção parcial ocorreu nesses genes. Nenhum dos isolados apresentou reação de PCR positiva para o gene mcr-1. A PCR para o gene mgrB foi positiva em 34 dos 35 isolados avaliados sendo que 23 isolados apresentaram o gene com o tamanho de aproximadamente 144 pares de base indicando que o mesmo estava intacto. Por outro lado, 11 isolados de K. pneumoniae (32,4%) apresentaram amplicons de mgrB com tamanho aumentado (em torno de 1500 bp), o que é compatível com a presença de IS. Um isolado apresentou resultado negativo na PCR para o gene mgrB, sugerindo deleção total do gene. Os 12 isolados resistentes aos carbapenêmicos e polimixina B com alteração no gene cromossomal mgrB tiveram seu genoma completo sequenciado. Os dados do sequenciamento foram processados e analisados com a utilização de ferramentas de bioinformática apropriadas (https://patricbrc.org; http://www.genomicepidemiology.org; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/), sendo comparados com sequências de referências depositadas. Genes relatados como responsáveis pela resistência à polimixina, como mgrB, pmrA, pmrB, pmrD, phoP e phoQ foram também analisados com os dados gerados pelo sequenciamento de todo genoma. Os 11 isolados clínicos com mgrB alterado (amplicon com tamanho molecular aumentado) tiveram seus dados se NGS analisados na plataforma National Center for Biotechnology Information (NCBI) por similaridade a sequências referências. Desta forma, foi possível identificar 5 famílias diferentes de IS: 5 isolados interrompidos por sequências da família IS5 (45,5%), 3 isolados da família ISKpn13 (27,3%) e 1 isolados das respectivas famílias: IS1, IS3 e IsKpn26. Um único isolado não mostrou amplificação do gene mgrB, sendo posteriormente confirmado a deleção por sequenciamento do genoma completo. Conforme nosso conhecimento, esses são os primeiros relatos de inserção de IS3, além de deleção total mutando o gene mgrB, em isolados provenientes do Brasil. Embora os resultados da técnica de PCR com primers para os outros genes relacionados a resistência cromossomal à polimixina (pmrA, pmrB, pmrD, phoP e phoQ) tenha indicado que todos estavam presentes e que não apresentavam alteração no tamanho molecular, foi possível identificar mutações missense e silenciosas através da análise dos dados de sequencimamento do genoma completo. As mutações encontradas incluiram: pmrA – missense mutation no isolado 4110 (L64R, D167E); pmrB – mutação missense no isolado 966 (S164P) e isolado 3854 (V300F), mutações missense e silenciosa no isolado 4110 (A84G, G111V, P145P, L233L); pmrD – mutação silenciosa (L25L); e phoQ – mutação silenciosa no isolado 4110 (I148I, S301S, D416D). Além de genes relacionados a resistência à polimixina, outros genes foram identificados a partir da análise in silico dos dados do sequenciamento de todo genoma: blaKPC e blaNDM (resultado esperado visto que os isolados eram resistentes aos carbapenêmicos), enzimas modificadoras de aminoglicosídeos incluindo acetiltransferases, fosfotransferases e nucleotidiltransferases; genes tet que conferem resistência a tetraciclinas bem como blaCTX-M que confere resistência a beta-lactâmicos. Os dados de sequenciamento confirmaram que nenhum isolado apresentava o gene mcr-1. Para determinar a sequence type (ST) dos isolados, os sete genes housekeeping (gapA, infB, mdh, pgi, phoE, rpoB e ton) foram avaliados in silico. Foram identificadas 4 diferentes STs, 6 isolados pertenciam a ST437 (50,0%), 4 isolados a ST11 (33,3%), 1 isolado a ST16 e 1 a ST340 (8,3%). Nossos resultados corroboraram com relatos anteriores sobre a resistência, mas também indicaram a complexidade que pode estar envolvida, muitas vezes tendo mais de um mecanismo envolvido na resistência. Cabe mencionar que um isolado com o gene mgrB com deleção total e um isolado com sequência de inserção IS3 alterando o gene, ambas as alterações não descritas anteriormente no Brasil.