Avaliação do microbioma de amostras de escarro de pacientes com doença pulmonar crônica na fibrose cística

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Volpato, Fabiana Caroline Zempulski
• Orientador(a): Barth, Afonso Luis
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Fibrose cística; Doença crônica; Microbiota; Escarro
• Palavras-chave em Inglês: Cystic fibrosis; Lung microbiome; Microbiological community; Culture-independent technique; ASV; 16S rRNA
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/246239

Base teórica: A Fibrose Cística (FC) é uma doença genética que acomete diversos órgãos, entretanto, as infecções crônicas das vias aéreas são uma das principais comorbidades que afetam estes indivíduos. A determinação do perfil microbiológico destas infecções crônicas é realizada através de técnicas tradicionais de cultivo. Dentre as bactérias comumente isoladas nas técnicas de cultivo predominam de forma mais significativa a Pseudomonas aeruginosa, o Staphylococcus aureus e espécies do complexo Burkholderia cepacia. Essas bactérias provocam infecções persistentes no pulmão do paciente com FC e são de difícil erradicação. Com base em tecnologias moleculares, sugere-se que há uma diferença na diversidade bacteriana nas vias aéreas e a qual pode estar associada a uma melhor evolução clínica da doença. As metodologias moleculares independem do cultivo bacteriano em meios de cultura e tem como base o sequenciamento do gene 16S rRNA que é bastante conservado em bactérias e permite identificar diferentes espécies. O sequenciamento do gene 16S rRNA tem a potencial capacidade de apresentar maior sensibilidade que as técnicas de cultivo tradicional, o que pode antecipar a detecção de um patógeno ou indicar a persistência deste no pulmão de pacientes com FC. Objetivo: Determinar o microbioma de pacientes com FC em amostras de escarro, afim de correlacionar a microbiota de pacientes jovens com o resultado da cultura bacteriológica tradicional, mutações em CFTR e presença de leucócitos no escarro. Métodos: Amostras de escarros de pacientes com FC foram coletadas para dois estudos distintos. No primeiro estudo uma amostra de escarro de 27 pacientes diferentes foram obtidos e, em um segundo estudo, foi determinado a presença do gênero Burkholderia através do microbioma em 22 amostras de escarros de 9 pacientes diferentes. Para ambos os trabalhos a biblioteca do 16S rRNA foi preparada usando a região V3V4 do gene e o produto de amplificação foi submetido a sequenciamento usando Illumina MiSeq. A determinação dos táxons presente na amostra foi realizado por Amplicon Sequence Variants (ASV). Resultado: Em relação ao primeiro estudo, a análise do microbioma detectou os gêneros Staphylococcus e Pseudomonas em todas as amostras de escarro. Na técnica de cultivo tradicional a espécie mais prevalente foi Staphylococcus aureus presente em 70,4% (19/27) das amostras de escarros analisadas, seguida por Pseudomonas aeruginosa em 33,3% (9/27) e complexo Burkholderia cepacia em 29,63% (8/27). Foi possível observar pelo microbioma uma diminuição significativa da diversidade bacteriana nas amostras de escarro com presença de leucócito e o mesmo ocorreu nas amostras oriundas de pacientes internados. Entretanto não foi observado variações estatisticamente significativas entre os microbiomas de pacientes com diferentes mutações no gene CFTR. No segundo estudo, através do microbioma foi possível detectar o gênero Burkholderia em pelo menos uma amostra dos 9 (100%) pacientes analisados, o que representou 63,64% (14/22) dos escarros analisados. Em contrapartida, na cultura bacteriológica foi identificada a Bcc em apenas 4 amostras de escarro de 3 diferentes pacientes. Cabe mencionar que os estudos acima foram os primeiros a determinar o microbioma pulmonar de pacientes com FC através da análise por ASV. Conclusão: Os resultados de ambos estudos indicaram que o microbioma pôde antecipar a detecção de gêneros de importância clínica (Pseudomonas, Staphylococcus e Burkholderia) em comparação com técnicas de cultivo laboratorial, e, com isso contribuir para um tratamento mais precoce. Além disso, a menor diversidade do microbioma pode ser relacionada a aumento do processo inflamatório (presença de leucócitos) bem como a necessidade de internação hospitalar.