Ferramentas alternativas para identificação microbiana, determinação de suscetibilidade e detecção de mecanismos de resistência

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Carneiro, Maiara dos Santos
• Orientador(a): Barth, Afonso Luis
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Farmácia; Polimixina B; Espectrometria de massas; Teste de ácido nucleico para COVID-19
• Palavras-chave em Inglês: Filter paper; MALDI-TOF MS; qPCR HRM; RT-qPCR; Polymyxin B
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/243074

O papel do laboratório de microbiologia clínica é realizar a identificação do microrganismo, determinar o perfil de suscetibilidade e, quando pertinente, os mecanismos de resistência, o mais breve possível. A microbiologia difere significativamente das demais áreas das análises clínicas, pois os processos são dependentes de crescimento microbiano, resultando em tempo maior para liberação de resultados. Tendo em vista que a replicação microbiana naturalmente demanda tempo, ferramentas para agilização de processos de caracterização microbiana devem ser priorizadas. O teste de referência para detecção de resistência à polimixina B, por exemplo, requer tempo de incubação prolongado (aproximadamente 24h). Tendo em vista a demora para obtenção do perfil de suscetibilidade através de métodos fenotípicos convencionais, se torna ainda mais importante a pesquisa por abordagens que forneçam resultados confiáveis em tempos de incubação menores. Por outro lado, as metodologias que utilizam as técnicas baseadas em espectrometria de massas (técnica de MALDI-TOF) e em amplificação de material genético (técnica de qPCR HRM) são consideradas referência para a identificação microbiana e de enzimas que degradam antiobióticos carbapenêmicos (carbapenemases), respectivamente. Considerando a atual situação sanitária decorrente do crescente aumento no número de casos de COVID-19, mesmo mais de dois anos após o início da pandemia, ainda existe a necessidade de ampliar a testagem através de metodologias que forneçam resultados confiáveis. A principal metodologia para detecção de SARS-CoV-2 é o RT-qPCR. As técnicas acima mencionadas, requerem, no entanto, equipamentos que apresentam elevado investimento inicial, o que os torna restritos a laboratórios de grande porte, com grande demanda de exames. Então um desafio importante é tornar possível que as vantagens dessas tecnologias possam ser utilizadas por laboratórios de pequeno porte. O uso de papel filtro para o transporte de amostras microbianas/biológicas pode facilitar significativamente o envio de microrganismos entre laboratórios. Os objetivos deste trabalho foram avaliar o papel filtro como meio de transporte de microrganismos/espécimes respiratórios inativados para identificação por MALDI-TOF MS, detecção de carbapenemases por qPCR HRM e SARS-Cov-2 por RT-qPCR. Assim como, propor e avaliar métodos rápidos para determinação de suscetibilidade à polimixina B. Para avaliar a capacidade do papel filtro como meio de transporte de microrganismos inativados para identificação por MALDI-TOF MS, foram avaliados 363 isolados da Ordem Enterobacterales, Bacilos Gram-negativos não-fermentadores, Haemophilus influenzae, micobactérias não tuberculosas e leveduras. Para detecção de carbapenemases por qPCR HRM foram avaliados 88 isolados da Ordem Enterobacterales. Para a detecção de SARS-CoV-2 por RT-qPCR foram avaliados 40 espécimes respiratórios de oro/nasofaringe transportados em papel de filtro. Os isolados/espécimes respiratórios foram inativados, impregnados em discos de papel filtro estéril, as proteínas (para identificação em MALDI-TOF MS) e o material genético (para as técnicas de qPCR HRM e RT-qPCR) foram extraídos. Os resultados após a impregnação em papel filtro foram comparados com os resultados diretamente da colônia/espécime respiratório. Para avaliação da leitura antecipada da microdiluição em caldo para polimixina B comparamos a concentração inibitória mínima (CIM) de 192 isolados de Bacilos Gram-negativos (Enterobacterales, Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa) obtida em 8-9h de incubação (leitura antecipada) e em 16-20h de incubação (leitura padronizada) da microdiuição em caldo para polimixina B. Além disso, deselvolvemos um novo teste qualitativo de suscetibilidade à polimixina B através do MALDI-TOF MS (MALDI POLYMYXIN TEST – MPT). Para essa proposta, comparamos os resultados de microdiluição em caldo de polimixina B de 95 isolados de Enterobacterales frente ao MPT. Considerando a correta identificação dos isolados com scores >1.7 em MALDI-TOF MS, 354/363 isolados apresentaram a mesma identificação diretamente da colônia e após o processo de impregnação em papel filtro. O método de transporte de microrganismo inativado apresentou alta sensibilidade (97,6%) e especificidade (100%) quando comparados a identificação realizada diretamente da colônia. O papel filtro também foi avaliado quanto a capacidade de transportar isolados bacterianos inativados para detecção de carbapenemases por qPCR HRM e 87/88 isolados apresentaram o mesmo resultado (presença ou ausência de carbapenemases). Apenas um isolado caracterizado previamente como blaNDM não apresentou o resultado esperado após a impregnação em papel filtro. Esse teste apresentou sensibilidade de 98,86% e especificidade de 100%. O papel filtro foi utilizado para o transporte de espécime respiratório para pesquisa de SARS-Cov-2 e apresentou resultados excelentes de concordância (97,2%) com o resultado obtido da extração direta do espécime respiratório. A leitura antecipada da técnica de microdiluição em caldo para polimixina B e o MPT apresentaram 97,9% e 95,8% de concordância categórica com o método de referência, respectivamente. O papel filtro pode ser utilizado como meio de transporte alternativo para os microrganismos e metodologias supracitadas. Tanto a leitura antecipada da microdiluição em caldo para polimixina B quanto o MPT apresentaram alta concordância com a microdiluição em caldo; portanto, essas metodologias poderiam ser empregadas na rotina do laboratório de microbiologia e possibilitariam a liberação do resultado de suscetibilidade à polimixina B no mesmo dia em que a bactéria é identificada.