Construção de um vetor para terapia gênica baseado no bloqueio da síntese protéica devido a expressão de elF2 beta truncado

• Ano de defesa: 2005
• Autor(a) principal: Salton, Gabrielle Dias
• Orientador(a): Chies, Jose Artur Bogo
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Terapia gênica; Sintese proteica : Genetica
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/274778

A terapia gênica tem sido explorada como tratamento para uma grande variedade de distúrbios genéticos, diminuição da progressão de tumores e no combate a infecções virais e doenças neurodegenerativas. A síntese protéica é um processo essencial à célula que envolve centenas de macromoléculas. A ausência ou a perturbação da função de qualquer um dos componentes no sistema de tradução pode comprometer o funcionamento celular. O fator eucariótico 2 de iniciação da tradução (eIF2) apresenta um papel-chave no processo de tradução do mRNA e na sua regulação, promovendo a ligação do Met-tRNAi à subunidade ribossomal 40S e fazendo a seleção do códon AUG no mRNA para início da tradução. O eIF2 é um heterotrímero formado pelas subunidades a, e g. A porção amino-terminal de eIF2b possui um domínio bastante marcante composto por três blocos de seis a oito resíduos de lisina altamente conservados, que são responsáveis pela ligação do eIF2 ao mRNA e a outros dois fatores de iniciação, eIF5 e eIF2B. Estudos anteriores mostraram inibção do crescimento em Saccharomyces cerevisiae pela expressão de eIF2b desprovido dos blocos de lisinas, mesmo na presença da forma celular selavagem dessa proteína (Laurino JP, dados não publicados). Esse resultado sugere o gene de eIF2b humano como um forte candidato à terapia gênica direcionada principalmente ao tratamento de tumores. O objetivo do trabalho foi construir plasmídeos contendo fragmentos truncados de eIF2 beta humano (em relação à presença ou ausência dos três blocos de lisina) sob controle de um forte promotor humano. Essas construções poderiam ser capazes de expressar essas proteínas truncadas de maneira eficiente, competindo com eIF2b selvagem em células humanas. Esse trabalho resultou na construção de quatro plasmídeos de expressão induzida por tetraciclina em eucariotos contendo os seguintes diferentes fragmentos sob controle do forte promotor de citomegalovírus (CMV): 1) eIF2b humano selvagem; 2) eIF2b humano desprovido dos três blocos de lisinas; 3) porção 13 amino-terminal de eIF2b humano brangendo os blocos de lisinas); 4) porção carboxi-terminal de eIF2b (não abrangendo os blocos de lisinas). Também se obteve como resultado mais duas construções: um plasmídeo expressando o gene de uma variante da proteína verde fluorescente (EGFP) sob controle do promotor de CMV e o gene do repressor de tetraciclina, para ser usado na transfecção de células humanas, concomitantemente, com uma das quatro construções referidas acima. Um outro plasmídeo, contendo o cDNA de eIF2b humano fusionado a um “tag” de biotina para sua expressão em Escherichia coli também foi construído. É possível que a expressão de formas truncadas de eIF2b possa ser utilizada como uma nova estratégia de terapia gênica anti-proliferação celular direcionada, principalmente, a células tumorais.