Quantificação da expressão gênica de Amblyomin-X clonado em Escherichia coli BL21(DE3) e correlação com sua síntese proteica.

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: Santos, Murilo Marconi dos
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Amblyomin-X; Bioprocesses; Bioprocessos; Correlação; Correlation; Expressão gênica; Gene expression; Protein synthesis; Síntese proteica
• Link de acesso: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/87/87131/tde-04122018-100546/

O presente projeto analisou a expressão gênica de Amblyomin -X, uma proteína com potencial terapêutico expressa em Escherichia coli BL21(DE3), por intermédio de um vetor de expressão plasmideal induzido por IPTG ( Isopropyl α-D-1-thiogalactopyranoside). A quantificação da expressão gênica foi realizada utilizando a técnica de RT-qPCR absoluta. A molécula Amblyomin-X corresponde a um inibidor de serino protease do tipo Kunitz, que apresenta atividade antitumoral e anticoagulante. Devido a sua importância terapêutica, fez-se necessário implementar um protocolo de escalonamento de produção, utilizando biorreatores. A informação sobre expressão gênica pode ajudar a interpretar o funcionamento do microrganismo durante os cultivos em frascos agitados e biorreatores, auxiliando na obtenção de protocolos de cultivo. A partir do momento da indução do gene Amblyomin-X, a bactéria Escherichia coli recombinante direciona grande parte de seu metabolismo para a expressão e produção dessa proteína, que é expressa em forma de corpos de inclusão insolúveis. As proteínas em forma de corpos de inclusão insolúveis permitem uma fácil extração do produto, porém, dificulta na quantificação por técnicas cromatográficas, por esse motivo, buscou-se também uma correlação entre a expressão gênica e a síntese protéica de Amblyomin-X, com o objetivo de validar a quantificação por RT-qPCR como uma forma indireta de quantificação desse tipo de produto protéico. Poucos estudos abordam a correlação existente entre a expressão gênica e a síntese protéica de um gene e sua proteína, e essa comparação poderia, também, revelar aspectos importantes entre a transcrição e a tradução de proteínas heterólogas em microrganismo. Foram realizados experimentos em frascos agitados em duas diferentes temperaturas indução (37°C e 30°C), com a concentração do indutor IPTG de 1 mM e concentração da biomassa (X) de 0,2 g/L. Para os experimentos em biorreatores utilizou-se o ponto central do planejamento experimental com concentração de IPTG 1mM e mais duas condições com concentração de IPTG 0,1 mM e 2mM. Foi encontrada uma grande similaridade entre os gráficos das análises cinéticas referentes a expressão gênica e a velocidade específica de formação do produto (qP). Não foi possível Identificar uma semelhança entre o perfil referente a análise cinética da expressão gênica comparada com a síntese protéica. Esses resultados sugerem que a expressão gênica apresenta uma cinética semelhante a velocidade específica de formação do produto e não necessariamente a concentração de proteína. Não foram encontradas correlações significativas nas análises de cada momento após a indução, exceto pelo ponto t4 do biorreator 14, quando foram correlacionadas a expressão gênica e a velocidade de formação do produto (r=0,998 e valor P=0,03).