Desenvolvimento de vetores nanotecnológicos lipídicos do sistema CRISPR/Cas9 visando à terapia gênica para Mucopolissacaridose tipo I

• Ano de defesa: 2017
• Autor(a) principal: Schuh, Roselena Silvestri
• Orientador(a): Teixeira, Helder Ferreira, Baldo, Guilherme
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: eng
• Palavras-chave em Português: Terapia gênica; Mucopolissacaridose I; Lipossomos; Nanoemulsões
• Palavras-chave em Inglês: CRISPR/Cas9; Nonviral vectors; Mucopolysaccharidosis; Gene therapy
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/175139

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é causada pela deficiência de alfa-L-iduronidase (IDUA), responsável pelo catabolismo de glicosaminoglicanos (GAGs), levando ao acúmulo multissistêmico de sulfato de heparano e dermatano. Este estudo tem por objetivo avaliar o potencial de sistemas lipídicos nanoestruturados como carreadores do plasmídeo do sistema CRISPR/Cas9 e um vetor doador da sequência do gene IDUA/Idua para edição gênica em fibroblastos de pacientes e em modelo murino de MPS I. Foram produzidos lipossomas (DOTAP, DOPE e DSPE-PEG) e nanoemulsões (e TCM) por homogeneização à alta pressão e microfluidização. O DNA foi associado às formulações por adsorção, ou por encapsulamento dos complexos pré-formados DNA/DOTAP no núcleo oleoso da nanoemulsão. A eficiência de transfecção dos complexos foi avaliada em fibroblastos de pacientes MPS I e ocorreu um aumento significativo da atividade de IDUA em 2, 15 e 30 dias após os tratamentos, que promoveu uma redução na quantidade de lisossomos nos fibroblastos tratados. A caracterização físico-química de formulações produzidas por microfluidização complexadas a somente um plasmídeo ou juntamente com um oligonucleotídeo foi verificada e pode-se afirmar que a capacidade de complexação e transfecção depende diretamente do tipo celular e da relação de cargas, e não há implicações quanto ao tamanho das sequências de ácidos nucleicos. Camundongos MPS I receberam os complexos lipossomais por injeção hidrodinâmica e sua biodistribuição foi detectada principalmente no pulmão, coração e fígado. A atividade sérica de IDUA normal aumentou em cerca de 6% e foi mantida por seis meses. A atividade aumentada no pulmão, coração, fígado e rim após eutanásia promoveu redução dos GAGs na urina e nos mesmos tecidos, corroborando com as análises histológicas. Em um estudo em andamento, foi realizada uma investigação mais aprofundada do efeito do tratamento lipossomal na morfologia óssea, sistemas cardiovascular e respiratório, e funções cerebrais dos animais tratados. A análise ecocardiográfica demonstrou uma melhora na hipertrofia e contratilidade do coração, porém não houve melhora na espessura das válvulas. O diâmetro da aorta foi similar ao de animais normais, porém as quebras de elastina ficaram entre o grupo normal e o não tratado. A morfologia facial dos animais tratados foi intermediária, assim como a espessura do osso zigomático. Entretanto, o osso femoral demonstrou espessura comparável ao normal. Já a resistência pulmonar apresentou uma tendência de redução nos animais tratados em relação aos animais MPS I. O conjunto de resultados demonstra o potencial das nanoestruturas lipídicas co-complexadas com o plasmídeo CRISPR/Cas9 e um vetor doador da sequência IDUA/Idua para terapia gênica da MPS I.