Nitroredutases : um estudo das possíveis funções na resposta ao estresse oxidativo

• Ano de defesa: 2013
• Autor(a) principal: Oliveira, Iuri Marques de
• Orientador(a): Henriques, João Antonio Pêgas
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Palavras-chave em Português: Nitrorredutases; Estresse oxidativo
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/78087

As nitrorredutases compreendem uma família de enzimas dependentes de flavina adenina mononucleotideo (FMN) capazes de metabolizar nitrocompostos usando nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD(P)H) como fonte de elétrons. Essas enzimas desempenham um papel central na metabolização de nitrocompostos recebendo grande atenção devido a sua habilidade em mediar a toxicidade desses compostos, tendo aplicações biotecnológicas e importância clínica. Essas enzimas podem ser encontradas em bactérias e em menor escala em fungos, protozoários e mamíferos. Em relação ao seu papel fisiológico, algumas hipóteses, como a participação na bioluminescência, homeostase metálica, biossíntese de cobalamina e resposta a estresse oxidativo têm sido propostas. Entretanto, não se tem conhecimento exato sobre a sua real função biológica. Neste cenário, este estudo tem como objetivo investigar possíveis funções das nitrorredutases no metabolismo de Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae, com ênfase na possível participação dessas enzimas na resposta ao estresse oxidativo. Para tanto, foi construída a rede de interações proteína-proteína das nitrorredutases NfsA e NfsB de E. coli e identificadas cinco sub-redes representando diferentes processos biológicos. Os resultados permitiram a elaboração de modelos sugerindo que as nitrorredutases de E. coli podem participar do metabolismo de ferro, manutenção do conteúdo de NADPH, metabolismo de compostos aromáticos e síntese de glicogênio. Estas vias podem contribuir nas respostas a estresse oxidativo e a limitação de nutrientes. Na levedura S. cerevisiae, foi determinada a influência das nitrorredutases Frm2p e Hbn1p na resposta a estresse oxidativo. Os resultados mostraram uma menor atividade basal de superóxido dismutase (SOD) e elevada sensibilidade a óxido de 4-nitroquinolina (4-NQO) e N-nitrosodietilamina (NDEA), indução de mutantes citoplasmáticos (petites), produção intracelular de ERO e peroxidação lipídica nas linhagens frm2 hbn1e frm2 hbn1quando expostas a estes agentes geradores de superóxido. Ainda foi observada elevada atividade basal de catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e conteúdo de glutationa (GSH) nas linhagens frm2 e frm2 hbn1. Estas linhagens possuem menor produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e peroxidação lipídica quando expostas aos peróxidos H2O2 e t-BOOH. Para elucidar os mecanismos pelos quais as nitrorredutases Frm2p e Hbn1p podem regular as defesas antioxidantes, foram identificadas, por biologia de sistemas, as interações dessas proteínas, tendo cinco sub-redes representando diferentes processos biológicos. Esta análise foi seguida por uma avaliação de índices de centralidade, que identificaram importantes proteínas da rede. Uma triagem dos fenótipos de sensibilidade a oxidantes foi realizada com linhagens proficientes e deficientes nestas proteínas identificadas e foram selecionadas as proteínas envolvidas nas respostas mais evidentes ao estresse oxidativo: as proteínas Ski8 (contribui na degradação do RNAm no sentido 3’-5’) e Cad1 (um ativador transcricional). Esta informação foi usada para a construção de linhagens duplo e triplo mutantes deficientes em Frm2p, Hbn1p, Ski8p ou Cad1p, seguindo a determinação da sensibilidade, acúmulo intracelular de ERO e nível de peroxidação lipídica na exposição a oxidantes e ainda a atividade basal de enzimas antioxidantes. Com base nos resultados obtidos, foi construído um modelo considerando que Cad1p ativa a expressão do gene FRM2 e a interação Frm2p-Ski8p regula as atividades das enzimas antioxidantes pela degradação do RNAm ou pela modulação da degradação dos transcritos do gene OLE1 (Ole1p atua na síntese de ácidos graxos insaturados) modificando a composição de ácidos graxos da membrana plasmática. A interação Hbn1p-Nab2p (Nab2p é necessária para a exportação do RNAm do núcleo para o citoplasma) controla a atividade de SOD pela exportação do RNAm.