Strategies for gene editing using the crispr system for the generation of genetically engineered livestock

• Ano de defesa: 2021
• Autor(a) principal: Oliveira, Gabriella Borba de
• Orientador(a): Bertolini, Marcelo
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: eng
• Palavras-chave em Português: Melhoramento genetico animal; Suinocultura; Bovinocultura; Reprodução animal
• Palavras-chave em Inglês: Gene editing; Epigenetic reprogramming; Homologous recombination; CRISPR activation system; Somatic cells; Embryo; Pig; Cattle
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/10183/233179

O melhor entendimento dos procedimentos de biologia molecular tem possibilitado o aprimoramento de estratégias de edição gênica, como o sistema CRISPR, possibilitando a modulação de genes em locais específicos do genoma, incluindo modificações de marcações epigenéticas, temas que foram abordados no Capítulo I. Os objetivos desta tese foram comparar diferentes estratégias utilizando o sistema CRISPR (a) para promover a reprogramação celular parcial de fibroblastos suínos utilizando o sistema de ativação com CRISPR (CRISPRa); e (b) avaliar a sobrevivência e a viabilidade de embriões bovinos após a microinjeção de zigotos com o sistema CRISPR/Cas9 e modelos de reparo de DNA para promover recombinação homóloga em safe harbor loci (SHL) em embriões bovinos produzidos por fecundação in vitro (FIV). No Capítulo II, as eficiências de duas nucleases de fusão com domínios de ativação (dCas9-VPR e dCpf1/Cas12a-VPR) foram comparadas para permitir a ativação da expressão transitória de genes alvo de reprogramação (Oct4, Myc, Klf4, Sox2 e Lin28a), e para alterar a transcrição de genes relacionados à senescência celular em células de suínos em passagens avançadas. A dCas9-VPR regulou positivamente genes únicos de forma mais eficaz do que a dCpf1-VPR, também usando menor número de gRNAs por gene, com maior nível de expressão para os genes Myc e Lin28a. Por outro lado, a dCas9-VPR não foi efetiva na regulação de múltiplos genes concomitantemente, embora tenham sido observados efeitos possivelmente relacionados aos genes-alvo, como a expressão dos genes p53 e Dkc1. O sistema CRISPRa promoveu a reprogramação in vitro parcial de células suínas em cultivo, apesar de em um nível menor do que o esperado. No Capítulo III, a sobrevivência in vitro e o desenvolvimento de embriões bovinos de FIV foram avaliados após a microinjeção citoplasmática (MI) do sistema CRISPR/Cas9 e de oligonucleotídeos de reparo de DNA em embriões no estádio de 1-célula, tendo como alvo os SHL H11 e Rosa26. Após a MIV por 20 h, CCOs bovinos foram fecundados in vitro por 8 h (grupos tratamento) ou por 18 h (grupo intacto). Grupos de zigotos foram parcialmente desnudados 8 h pós-fecundação (hpf) e, em seguida, segregados em grupos tratamento: Semi-desnudo (Semi), controle sem MI; grupo MI com CRISPR/Cas9; e grupos SHL, MI com CRISPR/Cas9, gRNA para cada SHL e uma das duas doses de oligonucleotídeos de reparo de DNA (5 ng/μL ou 20 ng/μL). Os embriões foram cultivados in vitro até o estádio de blastocisto, avaliando-se as taxas de sobrevivência pós-MI (D1), clivagem (D2) e de blastocisto (D7). A sobrevivência não foi afetada pela injeção do sistema CRISPR/Cas9, nem pelas doses ou os loci- alvo, embora a remoção parcial das células do cumulus com 8 hpf, ou a microinjeção de oligonucleotídeos de reparo de DNA com o sistema CRISPR/Cas9 reduziram o desenvolvimento a blastocisto (inferior a 20% na maioria dos grupos) em comparação com os controles (acima de 20%), independentemente da dose injetada ou do locus- alvo. A microinjeção com oligonucleotídeos de reparo de DNA com o sistema CRISPR/Cas9 se demonstrou viável para experimentos de recombinação homóloga em embriões bovinos de FIV, apesar da redução no desenvolvimento embrionário. Em conclusão, as estratégias utilizando o sistema CRISPR para auxiliar na edição gênica em cultivo de células somáticas suínas ou em embriões bovinos de FIV foram viáveis e relativamente eficientes. Por outro lado, a realização de outros experimentos será necessária para avaliar a viabilidade do uso de células de suínos reprogramadas para a clonagem, e a eficiência por análise genômica dos resultados das estratégias utilizadas para a recombinação homóloga em embriões bovinos.