Dificuldades no processo de construção de imunossensor para tipagem sanguínea ABO

• Ano de defesa: 2021
• Autor(a) principal: Silva, Pâmela Leite da
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Imonossensor; Tipagem sanguínea; Point of care; Lab on a chip; Immunosensor; Blood typing
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/213454

Os antígenos ABO são carboidratos adicionados à superfície da membrana das hemácias, que conferem o tipo A, B, AB ou O aos indivíduos. Pelo fato do organismo humano produzir naturalmente anticorpos regulares contra antígenos desse sistema, ele se torna o mais importante na prática transfusional. Entre os testes pré- transfusionais, destaca-se a fenotipagem do sistema ABO/Rh, (fase direta e reversa da tipagem sanguínea). Tal técnica baseia-se na hemaglutinação, com leitura subjetiva e sem interfaceamento digital. Com os avanços das metodologias de Point of Care e Lab on a Chip, biossensores são desenvolvidos para modernizar e otimizar técnicas manuais como essas. Dentre estes, destaca-se neste trabalho o imunossensor, que se baseia na ligação antígeno- anticorpo, detectada por um transdutor e convertido em informação digital. O objetivo deste trabalho é a construção de um imunossensor para tipagem sanguínea ABO. Foram utilizados anticorpos anti- A e - B monoclonais produzidos home made e policlonais purificados de plasma de bolsa de descarte, na concentração de 0,05mg/mL, que compuseram a molécula biorreceptora do imunossensor, fixados à superfície do eletrodo de carbono pelo polímero quitosana. A espectrofotometria UV-visível foi utilizada para monitoramento de construção do filme. As amostras analisadas foram de doadores de sangue do Hemocentro de Botucatu, que foram previamente fenotipadas conforme protocolo de doação em A, B e O. A técnica de construção do filme polímero + anticorpos foi a de automontagem por Layer-by-Layer, (LbL) que permite obter filmes finos compostos de anticorpos e polímeros, por adsorção física. O tempo de exposição da amostra sobre o imunossensor inicialmente foi de 5, 15 e 30 minutos e submetidas à medidas eletroquímicas e comparadas com sistemas controle positivo e negativo. Dadas as análises, os tempos de incubações passaram a ser de 1, 2,3,4 e 5minutos. A técnica de voltametria cíclica foi utilizada para caracterizar os filmes, monitoramento de cada camada depositada e para detecção de diferentes amostras de sangue. A absorção de luz em espectrofotometria na região UV-vis demonstrou que o número ideal de bicamadas para a composição do filme é de 2 bicamadas para o anti-B. Para o anti-A os resultados não foram conclusivos, embora a adsorção de luz fosse maior com 3 bicamadas, não houve pico de adsorção. Foi adotado então o número de duas bicamadas pra ambos os filmes dos dois anticorpos, para uso de anticorpos monoclonais. Os anticorpos policlonais foram funcionalizados com nanopartículas de ferro, à qual propiciaram o uso de uma única bicamada do filme. As leituras em Voltametria cíclica com o eletrodo Quitosana + Anti-A monoclonal demonstrou um alto potencial de especificidade com a hemácia A, quando incubados com a hemácia A e B por 5 minutos. Acima desse período observou a inespecificidade do imunossensor. Com o sensor contento Quitosana + Anti-B monoclonal os resultados não foram conclusivos, pois as análises de comportamento das curvas de voltamograma e as áreas dos mesmos não demonstraram diferenças entres as análises com hemácias A e B em todos os tempos analisados. Os eletrodos Quitosana + Anti-A e Anti-B policlonais funcionalizados com nanopartículas de ferro, tanto nos testes de especificidade, quando no de reprodutibilidade não demonstraram diferenças em amostras especificas e inespecíficas. Um dos principais problemas em potencial são os resquícios de albumina na purificação dos anticorpos que possam influenciar nas leituras e ser depositados de forma inespecífica sobre o filme. Além disso, a hipótese de que a hemácia é atraída quimicamente pela quitosana pode ser um dos fatores que influenciaram os resultados. Entretanto, pode-se afirmar que as nanopartículas permitiram uma melhor fixação de anticorpos da classe IgM em eletrodos impressos de carbono, o que era um grande desafio para construção desse biossensor. Diante disso, constata-se o grande potencial da produção de imunossensores para identificação do grupo sanguíneo ABO, sendo necessários ajustes para que o sistema se torne específico e reprodutivo.