Caracterização dos diferentes transcritos produzidos pelo locus HJURP (HollidayJunctionRecognizing-Protein) em células de glioblastoma

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: Petitto Netto, Renato
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Glioblastoma; HJURP; Transcritos; Isoformas; Transcripts; Isoforms
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/153391

RESUMO O glioblastoma (GBM) é o tipo mais comum e mortal de tumor cerebral, sendo que os pacientes apresentam uma sobrevida média de apenas 14 meses. O tratamento é realizado com remoção cirúrgica da massa tumoral, seguida de radioterapia e quimioterapia, porém sua eficácia é muito reduzida devido a acelerada atividade proliferativa e elevada resistência das células tumorais aos agentes genotóxicos. Dados do nosso grupo sustentam a hipótese de que este quadro pode estar associado em parte ao ganho de competência na atividade de reparo de DNA. Demonstramos anteriormente que, a HJURP (HollidayJunctionRecognizing Protein), uma proteína envolvida em reparo de DNA e montagem da cromatina centromérica, está superexpressa nos astrocitomas e que seus altos níveis de expressão estão correlacionados com o pior prognóstico dos pacientes. Dados da literatura evidenciam a existência de três RNAs mensageiros para o locus HJURP. O maior deles, denominado hjurp1, apresenta 9 éxons e codifica a isoformaprotéica A, que contém 748 aminoácidos. Os transcritos 2 e 3 apresentam deleção de alguns éxons, codificando proteínas hipoteticamente menores. Embora existam vários cDNAs depositados no GenBank que corroboram a expressão destes três mRNAs, não há dados na literatura sobre seu padrão de expressão ou a funcionalidade destas isoformas. Sendo assim, neste projeto avaliamos a expressão dos diferentes transcritos do locus HJURP em células de GBM, amostras de diferentes graus de astrocitoma, pares de linhagens de diferentes tipos não tumorais/tumorais e amostra de diferentes tecidos não tumorais. Através de PCR convencional detectamos as três isoformas nos astrócitos não tumorais (ACBRI371) e nas linhagens tumorais U87MG, U138MG e U251MG. Porém, as linhagens T98G e U343MG apresentaram variações, sendo que nas células T98G foram detectadas somente as isoformas 1 e 3, e nas células U343MG apenas a isoforma 1. Através de análise por PCR quantitativo, observamos que as linhagens de GBM apresentamum aumento marcante na expressão dos três transcritos de HJURP quando comparados aos astrócitos não tumorais ACBRI371. Como esperado, as células T98G apresentaram os maiores níveis de HJURP, sendo que a expressão dos três transcritos está aumentada. Além disso, percebemos que o transcrito hjurp1 é de fato bem mais abundante que as isoformas 2 e 3 nas linhagens celulares. Embora tenha sido observado um significativo aumento global para todas as isoformasnas amostras tumorais (tumores versus substância branca), percebemos que a isoforma 2 é mais abundante que a 1 no tecido não tumoral e astrocitomas de baixo grau (AST2), porém há um ganho de expressão da isoforma 1, que não é acompanhado pela isoforma 2, nas amostras de astrocimotas de grau 3 (AST3) e GBM, criando perfis de expressão característicos da progressão tumoral. Análises de expressão de um painel de tecidos não tumorais e pares de linhagens tumorais e não tumorais de outras origens, mostraram resultados similares, consolidando a existência de uma desregulação nos transcritos de HJURP que favorece a expressão da isoforma 1 nas células tumorais. Ensaios recentes demonstraram que o silenciamento dirigido ao transcrito 1 de HJURP nas linhagens U87MG e T98G, parece estimular a expressãoda HJURP 2 e mostra um impacto reduzido sobre a viabilidade celular, quando comparado ao silenciamento da proteína HJURP total. Esses dados sugerem que ao isoformas 2 e 3 estão ativas e auxiliam na manutenção da viabiliadde celular em linhagens de GMB. Palavras-chave: Glioblastoma. HJURP.Transcritos.Isoformas.