Estudos moleculares e caracterização biofísica da hemoglobina de Amynthas gracilis (HbAg)

• Ano de defesa: 2022
• Autor(a) principal: Sebastião, Isis
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Hemoproteínas; Marcadores bioquímicos; Transcriptoma; Minhocas; Sequenciamento de nucleotídeo
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/235780

Espécies de minhocas são comumente utilizadas em pesquisas de ecotoxicologia por possuírem características que auxiliam na identificação de poluentes no meio ambiente. Com o avanço da biologia molecular foi possível rastrear proteínas que podem ser utilizadas como marcadores de contaminação ambiental, é o caso da Hemoglobina extraída da espécie de Amynthas gracilis (HbAg). Conhecida como Hb extracelular gigante, a HbAg é um complexo proteico com massa molecular em torno de 3,6 MDa, com capacidade elevada de carreamento de moléculas de O2, estabilidade térmica e resistência ao estresse oxidativo. Todas essas propriedades fazem com que essas Hbs sejam alvo de pesquisas dentro da área de biotecnologia. O objetivo deste trabalho foi anotar o transcriptoma de A. gracilis, permitindo dessa forma, identificar sequências de proteínas com potencial biotecnológico, assim como as sequências codificadoras para a cadeias que compõem a HbAg. Além disso, foi realizado um estudo inicial de caracterização de uma das cadeias dessa hemoproteína, o monômero-d. A montagem do transcriptoma foi realizada utilizando estratégia de novo com o programa Trinity e a anotação funcional foi realizada com o programa OmicsBox que inclui a ferramenta do Blast2GO. As sequências das cadeias de HbAg foram identificadas através da análise de BLAST contra o banco de dados UniprotKB. O modelo para a unidade biológica HbAg foi construído por modelagem comparativa com auxílio do SWISS-model e os esquemas foram desenhados com o programa PyMOL. A caracterização inicial do monômero-d de HbAg foi feita através das técnicas de espectroscopia: absorção UV-Vis e fluorescência, além da técnica de espalhamento de luz (LSI) variando as condições experimentais em função do pH e interação com o surfactante SDS. Foram identificadas 260.616 ORFs das quais 187.866 sequências foram não redundantes e, a partir destas foram anotadas 92.939 sequências de proteínas. Proteínas com potencial biotecnológico assim como classes de enzimas envolvidas no processo de vermicompostagem foram identificadas. Todas as sequências das cadeias de HbAg foram preditas e partir delas construímos um modelo comparativo com base na estrutura de HbGp, Hb homóloga a HbAg. Todos os domínios proteicos mantiveram-se conservados em HbAg. Para o conjunto de dados do monômero-d em função do pH, notou-se auto-oxidação do grupo Heme em pH 9, aumento da intensidade de fluorescência em pH mais básico e possível auto agregação no pH mais ácido (5,0) e pH mais básico (9,0). Já para a interação com o SDS, notamos uma oxidação mais pronunciada a partir da concentração de 4 mmol L-1. O aumento gradativo da intensidade de fluorescência foi observado a partir da concentração de 1,2 mmol L-1 de surfactante. Os dados de LSI levantam a hipótese da formação de agregados entre o monômero-d e o surfactante assim como a presença de auto agregados de monômero em solução. Os dados apresentados neste trabalho trazem conhecimento básico acerca do potencial de A. gracilis no campo da biotecnologia e poderão fomentar pesquisas futuras nas áreas de genômica, com enfoque para o desenvolvimento e caracterização de biomarcadores moleculares na investigação de contaminação ambiental.