Avaliação da especificidade e da capacidade produtiva da enzima friedelina sintase a partir de estudos de mutação sítio-dirigida

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Botero, Weslei Bruno [UNESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Maytenus; Espinheira-santa; Biossíntese; Terpenos; Genômica
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/243067

Plantas constituem uma das principais fontes de produtos naturais bioativos, sendo capazes de sintetizar substâncias complexas e estereoespecíficas utilizadas para o tratamento de diversas doenças. Dentre essas substâncias, a friedelina se destaca pelo potencial gastroprotetor, antimicrobiano, hipolipemiante e por possuir uma carbonila na posição C-3 que faz com que a mesma seja precursora de substâncias com propriedades citotóxicas como a pristimerina, o celastrol e a maitenina, marcadores taxonômicos da família Celastraceae. Ademais o alto potencial terapêutico, a quantidade produzida desses metabólitos pelas plantas é pequena, de modo que alternativas de engenharia metabólica, com a expressão dos genes de plantas em sistemas heterólogos aliada à engenharia de proteínas para otimizar e aumentar a atividade das enzimas, vêm se mostrando promissoras. Desse modo, esse estudo avaliou a expressão da enzima friedelina sintase de Monteverdia ilicifolia (Celastraceae) e Populus davidiana (Salicaceae) em Saccharomyces cerevisiae. Resíduos específicos de ambas as enzimas foram modificados geneticamente por meio de reações de mutação sítio-dirigida, sendo as posições selecionadas a partir do uso do alinhamento múltiplo de sequências (MAS) e a análise da interação entre o sítio catalítico da enzima modelada e o produto friedelina. Após a obtenção dos genes mutantes, a sequência codificadora das enzimas foi clonada em um vetor de expressão, sendo o DNA recombinante transformado em levedura. Posteriormente, essa linhagem foi cultivada em meio seletivo e os terpenos extraídos e avaliados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GC-MS). O teor de friedelina produzido pelas leveduras foi quantificado através de uma curva analítica utilizando colesterol como padrão interno. O teor de friedelina obtido para as enzimas selvagens de M. ilicifolia e P. davidiana foram de 2,024 ±0,169 mg/L e 1,024 ±0,072 mg/L, respectivamente. Dentre os mutantes avaliados, G533A apresentou um aumento na produção de friedelina de 1,8-3,6x (3,633 ±0,203 mg/L), enquanto as alterações na posição 729 resultaram em perda da função. As demais mutações apresentaram resultados mistos de acordo com a natureza da enzima mutada. Os resultados aqui apresentados são importantes para melhorar o entendimento sobre a estabilidade e capacidade produtiva dessas enzimas que produzem a friedelina, o único triterpeno carbonilado da cascata de rearranjos da via biossintética.