Efeito das toxinas microbianas provenientes de biofilme simples ou misto de Staphylococcus aureus e Candida albicans sobre monoculturas ou culturas 3D de células da mucosa oral

• Ano de defesa: 2016
• Autor(a) principal: Dias, Kássia de Carvalho [UNESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Estadual Paulista (Unesp)
• Palavras-chave em Português: Biofilmes; Queratinócitos; Candida albicans; Staphylococcus aureus; Necrose; Apoptose; Biofilms; Keratinocytes; Necrosis; Apoptosis
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/11449/148693

Esta presente tese foi dividida em quatro estudos que tiveram como objetivos. 1. Validar um protocolo e comparar o efeito dos tampões RPMI/MOPS e RPMI/HEPES no desenvolvimento de biofilmes e na viabilidade celular de queratinócitos (NOK-si e HaCat); 2. Comparar o dano celular e a resposta inflamatória induzidos pelos metabólitos de biofilmes simples e misto de Staphylococcus aureus e Candida albicans; 3. Avaliar o tipo de morte celular (apoptose vs. necrose) e a ativação de caspases relacionadas aos metabólitos desses biofilmes e 4. Caracterizar um tecido oral reconstituído e analisar o dano tecidual causado pelo sobrenadante e biofilme propriamente dito desses microrganismos. No estudo 1, a viabilidade celular foi avaliada pelo método colorimétrico do MTT e por imagens da cultura após 12 horas em contato com os meios de cultura. Ambos os tampões permitiram similar crescimento do biofilme. Efeito citotóxico do MOPS foi verificado após 6 horas de crescimento de NOK-si e HaCat. Houve preservação da viabilidade e morfologia quando as células foram expostas a RPMI/HEPES. Conclui-se que RPMI/HEPES pode ser utilizado como um meio tamponamente viável para estudos que avaliam o efeito do biofilme em cultura de queratinócitos ao longo do tempo. No estudo 2, o sobrenadante dos biofilmes de 36 h de C. albicans e S. aureus, isolados ou em associação, foi colocado em contato com NOK-si, HaCat e macrófagos (J774A.1). O dano celular foi avaliado por meio de ensaios de viabilidade celular (MTT) e liberação da enzima LDH. A produção de citocinas foi analisada pelo método de ELISA e a avaliação do tipo de morte celular pela marcação das células apoptóticas com anexina V e necróticas com iodeto de propídio. Biofilme misto e de C. albicans foram mais citotóxicos e o biofilme misto causou maior dano celular pela liberação da enzima LDH. Metabólitos do biofilme de S. aureus estimularam maior produção de NO, IL-6 e TNF-α. Maior quantidade de células marcadas com anexina V (apoptose) foram detectadas após exposição ao sobrenadante de C. albicans, e maior marcação para o iodeto de propídio (necrose) para as células expostas ao sobrenadante do biofilme misto. Os metabólitos de biofilmes mistos foram capazes de induzir maior dano celular e os metabólitos de S. aureus, maior resposta inflamatória. No estudo 3, a indução de morte celular em cultura de NOK-si foi avaliada após o contato com sobrenadante de biofilmes simples ou mistos, com diferentes tempos de formação (08, 16 e 24 horas). As células microbianas foram quantificadas em UFC/mL e os danos aos queratinócitos foram avaliados pelos ensaios de MTT e de liberação da enzima LDH. Houve marcação de apoptose e necrose como no estudo anterior e ensaio colorimétrico para detecção dos marcadores de apoptose celular (caspases). A morfologia celular dos queratinócitos foi avaliada por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Houve um aumento progressivo nos valores de UFC/mL obtidos dos biofilmes de 08 horas para 16 horas, tanto para os biofilmes simples, quanto para os mistos. Houve uma redução progressiva na viabilidade celular após exposição ao biofilme de 16 horas quando comparado ao biofilme de 08 e 24 horas. As imagens de MEV mostraram uma diminuição das microvilosidades e a formação de vesículas na membrana das células expostas ao sobrenadante do biofilme de 16 horas. Houve também maior marcação de anexina V quando as células foram expostas ao sobrenadante de biofilmes simples de C. albicans e S. aureus; e com iodeto de propídio para o biofilme misto. A apoptose induzida pelos sobrenadantes do biofilme de S. aureus e misto foi associada à ativação das caspases -2, -3, -6 e -8; e o aumento da atividade da caspase -3 para sobrenadante de C. albicans. Assim, maior dano celular pode ser observado quando queratinócitos foram expostos a metabólitos dos microrganismos em sinergismo no biofilme. No estudo 4, tecido oral reconstituído foi obtido pela formação in vitro de um equivalente de tecido conjuntivo (fibroblastos e colágeno) e uma camada epitelial (queratinócitos). A caracterização histológica foi obtida pelas colorações de Hematoxilina-Eosina, Ácido Periódico de Schiff - P.A.S. e Picrosirius e a caracterização imunohistoquímica pela evidenciação de citoqueratina 13 e 14, Ki-67 e colágeno IV. A análise do dano causado ao tecido pelo sobrenadante e biofilmes, com 08 e 16 horas, foi observada por meio da liberação da enzima LDH e avaliação histológica (Hematoxilina-Eosina). O biofilme misto foi responsável pela maior destruição tecidual. O tecido epitelial reconstituído apresentou características histológicas e imunohistoquímicas semelhantes ao epitélio oral e pode ser utilizado para investigar padrões de infecção causada por biofilmes em culturas simples e mista de C. albicans e S. aureus.