Detalhes bibliográficos
| Ano de defesa: |
2019 |
| Autor(a) principal: |
Pereira, Waldir Eduardo Simioni |
| Orientador(a): |
Não Informado pela instituição |
| Banca de defesa: |
Não Informado pela instituição |
| Tipo de documento: |
Dissertação
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| Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
| Idioma: |
por |
| Instituição de defesa: |
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
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| Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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| Departamento: |
Não Informado pela instituição
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| País: |
Não Informado pela instituição
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| Palavras-chave em Português: |
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| Link de acesso: |
http://hdl.handle.net/11449/182090
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Resumo: |
Proteases são enzimas cuja função é a hidrólise de proteínas e peptídeos, gerando produtos de variados tamanhos. São produzidas pelos mais diversos organismos vivos e possuem um amplo espectro de aplicações. O objetivo desse trabalho foi promover a expressão heteróloga de uma protease coagulante produzida por Thermomucor indicae-seudaticae em Escherichia coli e Pichia pastoris, através da identificação do gene codificador da enzima. Para isso, foi realizada a comparação entre o genoma de T. indicae-seudaticae e Rhizomucor pusillus utilizado como referência. Os vetores pET 28ª (+) e pPICZαA foram sintetizados contendo o gene de interesse para a transformação em E. coli e P. pastoris respectivamente. Células competentes de cinco diferentes linhagens de E. coli foram transformadas e submetidas a teste de expressão em 20 °C e 37 °C por 24 horas, analisadas tanto a fração solúvel, quanto insolúvel, onde apresentaram, aparentemente, a expressão com maior quantidade em fração insolúvel. Células de P. pastoris foram transformadas e submetidas a expressão por 72 horas. O extrato enzimático bruto do produto gerado da expressão foi caracterizado bioquimicamente. A enzima recombinante produzida por E. coli apresentou máxima atividade de 250,89 U mL-1 utilizando caseína como substrato nas condições de pH 5,0 e temperatura de 50 °C, porém com estabilidade após 24 horas apenas nos pH 6,0 e 6,5, demonstrando assim ser sensível em pH alcalino. Enquanto que a enzima recombinante produzida por P. pastoris apresentou máxima atividade de 57,82 U mL-1 nas condições de pH 5,0 e temperatura de 60 °C. Ainda a enzima produzida por P. pastoris apresentou melhor termoestabilidade quando comparada com a produzida por E. coli e ambas as enzimas tiveram forte inibição da atividade por pepstatina A, confirmando pertencer a classe das proteases aspárticas e também pelo íon mercúrio o que confirma a presença de pontes dissulfeto na estrutura da enzima. |
