Construção de cassetes de expressão para silenciamento gênico de fatores antinutricionais da soja, via interferência por RNA

• Ano de defesa: 2006
• Autor(a) principal: Barros, Beatriz de Almeida
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Genética animal; Genética molecular e de microrganismos; Genética quantitativa; Genética vegetal; Me; Mestrado em Genética e Melhoramento; UFV
• Palavras-chave em Português: Soja; RNAi; Fatores antinutricionais; Soybean; Antinutritional factors; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA::GENETICA MOLECULAR E DE MICROORGANISMOS
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/4784

A soja é uma das mais importantes culturas do mundo e como apresenta um alto teor protéico, ela tem sido muito utilizada na alimentação animal e humana. Apesar disso, as proteínas encontradas na semente desta leguminosa não são consideradas ideais por apresentarem baixo teor de metionina e lisina, além de fatores alergênicos e de inibidores de proteases. Dentre estes fatores antinutricionais estão a proteína P34 e os inibidores de protease do tipo Bowman-Birk. A ausência destes fatores aumentaria a qualidade da semente de soja, bem como a tornaria disponível para uma faixa mais ampla de consumidores. Recentes avanços na biotecnologia vegetal têm possibilitado o silenciamento completo ou em altos níveis de genes específicos. Uma destas técnicas é conhecida como interferência por RNA ou RNA interference. Este método é altamente eficiente e a clivagem do mRNA alvo é induzida pela presença de pequenos RNAs dupla fita na célula. O objetivo deste trabalho foi a construção de cassetes de expressão para silenciamento gênico, via interferência por RNA, dos inibidores de protease do tipo Bowman-Birk e da proteína P34 em sementes de soja. Para a expressão semente-específica dos transgenes, primers específicos foram desenhados para a amplificação da região promotora do gene da subunidade [alfa] da [beta]-conglicinina. A estes oligonucleotídeos foram adicionados sítios de restrição Sac I e Xho I - adequados para sua clonagem em vetores de expressão em plantas. Foram clonados 634 pb no vetor pGEM-TEasy. A clonagem foi confirmada por PCR, clivagem enzimática e sequenciamento do clone isolado. A seqüência clonada foi analisada in silico para a identificação de cis-elementos relacionados à expressão semente específica de genes colocados sob controle deste promotor. Os elementos TATA box, CAAT box, RY LEG box e RY FLEB box encontrados. O fragmento de interesse foi, então, isolado do vetor pGEM-TEasy por clivagem com as enzimas Sac I e Xho I e inseridos em vetores de expressão em plantas (pKANNIBAL) originando o vetor pBKN. Para a construção dos cassetes de expressão, a escolha da região do cDNA de cada gene de interesse a ser amplificada foi determinada com o auxílio do programa BLOCK-iTTM RNAi Designer (INVITROGEN), e os primers específicos foram desenhados de acordo seqüências depositadas no banco de dados público GenBank. Inicialmente foi feita, por meio de RTPCR, uma análise da expressão dos genes de interesse durante o desenvolvimento da semente e em demais órgãos da planta (raiz, caule e folha). Essa análise evidenciou expressão contínua e abundante desses genes durante todo o desenvolvimento da semente bem como a presença de transcritos correspondentes em todos os órgãos vegetais analisados. Após sua amplificação, todos os fragmentos obtidos a partir de cDNA de semente foram sequenciados e sua identificação foi confirmada por meio de alinhamento utilizando o programa BLAST. Para a clonagem da seqüência sense, os vetores pKANNIBAL e pBKN, além dos fragmentos amplificados referentes aos genes de interesse, foram clivados com as enzimas Xho I e Kpn I. A reação de ligação foi realizada utilizando T4 DNA ligase e células de Escherichia coli ultracompetentes foram transformadas por meio de choque térmico. Os transformantes foram analisados por PCR e reação de clivagem enzimática. A clonagem do fragmento antisense foi realizada da mesma forma, utilizando as enzimas Xba I e Cla I e os clones contendo o fragmento sense como vetores. Em seguida, as construções foram transferidas para o vetor binário pCAMBIA 3301 e confirmadas por PCR.