Extração e purificação de proteínas estruturadoras de gelo obtidas de folhas de trigo

• Ano de defesa: 2014
• Autor(a) principal: Campelo, Flávia Assunção
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Ciência de Alimentos; Tecnologia de Alimentos; Engenharia de Alimentos; Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos; UFV
• Palavras-chave em Português: Trigo - Folhas; Gelo - Extração; Gelo - Purificação; Gelo - Estrutura - Proteína; Wheat - Leaves; Ice - Extraction; Ice - Purification; Ice - Structure - Protein; CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::CIENCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS::CIENCIA DE ALIMENTOS
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/2946

Quando certos organismos são submetidos a temperaturas baixas, eles tendem a desenvolver mecanismos de sobrevivência, como a produção de proteínas específicas, conhecidas como proteínas estruturadoras de gelo (ISP, por sua denominação em inglês, ice structuring proteins. Pertencem a uma classe de polipeptídeos capaz de inibir o crescimento dos cristais de gelo durante a nucleação, reduzindo assim os danos na estrutura celular desses organismos causados pela formação dos cristais. Em alimentos processados submetidos ao congelamento, o controle do crescimento dos cristais de gelo é crítico na prevenção de danos à qualidade final do produto, sendo, portanto, objeto de interesse pelas indústrias e pesquisadores do setor. Apesar de as ISP já terem sido extraídas de folhas de trigo e de outros cereais, ainda não se definiu uma metodologia de extração e purificação adequada e eficiente, objetivo pelo qual o presente estudo foi realizado. Cultivares de inverno (Ok Bullet e Endurance) e de primavera (Pioneiro) foram semeadas em potes plásticos com três repetições de cada, cresceram em condições controladas em câmara de crescimento com sistema de refrigeração, com temperaturas entre 4 e 7 ° C (plantas aclimatadas ao frio). Outras três repetições de cada cultivar foram mantidas em condições ótimas de crescimento (plantas sem aclimatação ao frio), em temperaturas de 23 à 25 ° Um pote de cada repetição, aclimatadas e não C. aclimatadas, foi retirado da câmara a cada sete dias, e suas folhas foram colhidas durante um período de 49 dias de crescimento. As folhas de cada cultivar, após liofilizadas, foram divididas em dois grupos, E1 ou E2, que se diferenciavam pelo processo de extração. Na metodologia E1, as folhas foram cortadas, trituradas com Tris-HCl (pH=7,4), centrifugadas e filtradas para obtenção do extrato. Em E2, as folhas foram trituradas com solução tampão de ácido ascórbico: cloreto de cálcio (pH=3,0) e passaram por um processo de impregnação à vácuo. Os extratos brutos obtidos por E1 e E2 foram submetidos a três processos de purificação, P1, P2 e P3. Na metodologia P1, as amostras foram tratadas com acetona, em P2 com éter etílico: éter de petróleo (1:1) e em P3, foi utilizado clorofórmio. Na metodologia P1, os extratos foram agitados em vórtex, centrifugados e o precipitado ressupendido para obtenção do extrato purificado. Em P2, foram agitados em vórtex e decantados. Em P3, os extratos foram agitados em vórtex e centrifugados. Os extratos brutos e purificados foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). O teor de sólidos variou de 1456,00 a 1543,00 mg/100g para E1 e de 850,00 a 980,00 mg/100g, para E2 . Pela metodologia E1, os teores de proteína foram de 201,84 mg/100g, 217,71 mg/100g e 270,49 mg/100g, para as cultivares Pioneiro, Ok Bullet e Endurance, respectivamente. Para a extração E2 esses valores foram de 118,45 mg/100g, 357,96 mg/100g e 395,33 mg/100g. Os extratos obtidos por E1 e E2 apresentaram teores de cinzas de 2,0 % e 1,98 % para cultivar Pioneiro, para Ok Bullet (2,11 % e 2,07 %) e para Endurance (2,13 % e 2,10 %) respectivamente. Nos extratos de folhas aclimatadas ao frio, obtido pela extração E1 foram identificadas uma proteína na faixa de 45,0 - 66,0 kDa e outra de 30,0 - 45,0 kDa para cultivar Pioneiro. Para Ok Bullet e Endurance, além dessas, foi observada uma terceira banda de 20,1 - 30,0 kDa e outras duas, uma na faixa de 66,0 - 97,0 kDa e outra de 45,0 - 66,0 kDa. Pela extração E2 foi observada apenas uma proteína na faixa de 20,1 - 30,0 kDa para as três cultivares. Comparada aos extratos controles de E1 e E2, a metodologia de purificação P1 produziu efeito significativo (p<0,05) somente para a cultivar Pioneiro, resultando em menor teor de proteína bruta após a purificação. O procedimento P3, produziu efeito similar nas cultivares Ok Bullet e Endurance, em relação a ambos os controles. O método de purificação P2 não é indicado para nenhuma cultivar, pois reduziu o teor proteico nos extratos E1 e E2. Após a purificação para cultivar Pioneiro, foram identificadas proteínas na faixa de 20,1-30,0 kDa e de 45,0-66,0 kDa, para as cultivares Ok Bullet e Endurance. Além das duas observadas na Pioneiro, constatou-se também a presença de mais duas proteínas, uma na faixa de 66,0-97,0 kDa e outra de 45,0-66,0 kDa, as mesmas faixas visualizadas nos perfis eletroforéticos dos extratos brutos obtidos por E1. Para os géis dos extratos purificados as mesmas proteínas observadas nos extratos brutos de E2, com massa molecular de 20,1 30,0 kDa foram visualizadas. A metodologia de extração E1 foi a mais eficiente para a cultivar Pioneiro enquanto que E2 foi a melhor para as cultivares Ok Bullet e Endurance. A purificação com clorofórmio (P3) foi mais eficiente na cultivar Pioneiro, enquanto a acetona (P1) foi melhor para as cultivares OK Bullet e Endurance. O presente trabalho indica que resultados de pesquisas desenvolvidas no exterior, não são necessariamente adequados às cultivares de trigo no Brasil. Trigos nacionais são essencialmente de primavera, e demandam pesquisas específicas, visto que demonstram potencial para obtenção de ISP com características diferentes daquelas produzidas por trigos de inverno.