Expressão das NTPDases 1 e 2 de Leishmania infantum chagasi em sistema bacteriano e de célula de mamífero e estudo de suas influências na infecção de células raw 264.7 e na expressão de purino receptores P2

• Ano de defesa: 2014
• Autor(a) principal: Bastos, Matheus Silva e
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal; Doutorado em Bioquímica Agrícola; UFV
• Palavras-chave em Português: Leishmaniose visceral; Enzimas; NTPDases; Expressão heteróloga; Visceral leishmaniasis; Enzymes; NTPDase; Heterologous expression; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/337

A Leishmaniose Visceral (LV) é um grave problema de saúde pública em vários países do mundo incluindo o Brasil. Atualmente tem se observado um número crescente de casos no homem e no cão, sendo este último considerado principal reservatório doméstico, responsável pela manutenção da doença em periferias de grandes cidades. O foco central deste trabalho é o estudo das Ecto-Nucleosídeo Trifosfato Difosfo Hidrolase 1 e 2 de Leishmania infantum chagasi (LicNTPDase-1 e 2), agente etiológico principal da LV no Brasil. As LicNTPDases 1 e 2 fazem parte da família das E-NTPDases, que são enzimas implicadas como fatores de virulência de alguns parasitos. Evidências indicam que as E-NTPDases participam da via de salvação de purinas e da modulação da resposta imune do hospedeiro dependente de nucleotídeos extracelulares. Essas enzimas têm sido apontadas como importantes alvos para o desenvolvimento de novas drogas e vacinas para as leishmanioses, tanto humana quanto canina. Neste trabalho foram feitas análises comparativas da expressão destas enzimas em sistema bacteriano (pET21 b) e em células de mamífero (COS-7). Foram avaliados diferentes protocolos de renaturação, bem como feita a comparação entre a atividade das enzimas em diferentes substratos. Além disto, foi avaliado se as enzimas recombinantes podem participar do mecanismo de adesão dos parasitos em macrófagos e se estas e se estas são capazes de modular a expressão de purino receptores P2. Os resultados demonstram que alterando o protocolo de renaturação das enzimas expressas em bactéria, é possível aumentar a atividade da LicNTPDase-2, mas o mesmo efeito não foi observado para LicNTPDase-1. Já quando é feita a expressão em COS-7 é possível observar um aumento significativo da atividade da LicNTPDase-1. Por outro lado foi possível verificar o mesmo padrão de atividade entre a LicNTPDase-2 expressa em bactéria e expressa em COS-7 o que indica que a renaturação usada na LicNTPDase-2 expressa em E. coli é suficiente para atingir o estado nativo similar a que foi observada para a enzima expressa em célula de mamífero. ixEnsaios de adesão na presença em ausência das enzimas recombinantes levaram a uma diminuição da infecção em macrófagos da linhagem RAW 264.7. Assim, foi possível confirmar a participação das LicNTPDases na adesão dos parasitos em macrófagos. Adicionalmente foi avaliado a expressão de mRNA de purino receptores P2 nos macrófagos RAW 264.7 na presença ou ausência das enzimas recombinantes. Foi possível verificar também a relação entre a presença destas enzimas e a modulação da expressão de alguns purino receptores P2, onde verificamos um aumento na expressão de P2X3, P2X5, P2Y2 e uma diminuição na expressão de P2Y13 para macrófagos incubados com LicNTPDase-1 e uma diminuição na expressão de P2X6 e P2X7 para macrófagos incubados com LicNPDase 2, quando os macrófagos foram infectados com Leishmania infantum chagasi, foi visto aumento na expressão dos receptores P2X2, P2Y12 e P2Y13, não foi possível verificar alterações para o restante dos receptores.