Isolamento e caracterização de bactérias ruminais com alta atividade específica de produção de amônia

• Ano de defesa: 2009
• Autor(a) principal: Lima, Janaina Rosa de
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Associações micorrízicas; Bactérias láticas e probióticos; Biologia molecular de fungos de interesse; Doutorado em Microbiologia Agrícola; UFV
• Palavras-chave em Português: Amônia; Rúmen; Desanimação; DGGE; Bacteriocinas; Ammonia; Rumen; Deamination; Bacteriocin; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::MICROBIOLOGIA::BIOLOGIA E FISIOLOGIA DOS MICROORGANISMOS
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/1543

Os objetivos deste trabalho foram avaliar a produção de amônia em bovinos alimentados com dietas contendo níveis crescentes de proteína bruta e averiguar o impacto da dieta sobre a diversidade genética do ecossistema ruminal; isolar e caracterizar fisiológica e geneticamente bactérias ruminais com alta atividade específica de produção de amônia e determinar o efeito de monensina e bovicina HC5 sobre a atividade de desaminação dos isolados bacterianos hiperprodutores de amônia. A produção total de amônia e a atividade específica de produção de amônia (AEPA) de culturas mistas e puras obtidas a partir do líquido ruminal de animal submetido a dietas contendo níveis crescentes de proteína foram analisadas. As culturas foram incubadas em meio mineral anaeróbio contendo Trypticase (15 g/L) e a atividade de desaminação foi determinada. A diversidade genética da microbiota ruminal do animal alimentado com dieta contendo concentrações crescentes de proteína e das culturas de enriquecimento transferidos in vitro na presença de Trypticase foi analisada por Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Verificou-se que a habilidade de desaminar aminoácidos variou entre as culturas de bactérias ruminais colhidas de bovino alimentado com 8, 18 e 24 % de proteína bruta (PB). Alíquotas de líquido ruminal que foram diluídas sucessivamente (incrementos de 10 vezes) apresentaram menor atividade de desaminação de Trypticase. A AEPA decresceu linearmente com a diluição da microbiota ruminal, tendo sido inferior a 10 nmoles de amônia/mg proteína/min após a diluição 10-4 (8 e 18% de PB) ou 10-5 (24 % de PB). A análise da diversidade genética da microbiota ruminal pela técnica de DGGE não indicou mudanças significativas na composição da comunidade microbiana entre o primeiro e o último dia de alimentação com cada dieta. Para as transferências a partir da dieta com 8%, 18 % e 24 % de PB, observou-se variação nos perfis de bandas correspondentes às diferentes espécies microbianas presentes nas amostras. A cultura oriunda da dieta contendo 24% de PB foi a que apresentou maior produção de amônia e adaptação mais rápida a Trypticase. Bactérias que apresentaram alta atividade específica de produção de amônia foram isoladas e parâmetros metabólicos foram avaliados. As estratégias de isolamento utilizadas permitiram a obtenção de quatorze isolados (culturas 27B, 35, 53P, 57A, 86A, 86C, 92B, 99A, 102, 102B, 103, 15A, 15B e CT2) com alta atividade específica de produção de amônia. Esses microrganismos foram caracterizados como bastonetes gram-positivos, capazes de produzir esporos termoresistentes e de crescerem em condições de anaerobiose. Os resultados obtidos indicaram que os isolados se diferenciam quanto à taxa de desaminação e velocidade de crescimento em meio contendo Trypticase. Entretanto, foi observado que esses isolados compartilharam características culturais e produtos de fermentação comuns. As análises bioquímicas dos microrganismos relacionados nesse trabalho mostraram que vários isolados foram capazes de fermentar carboidratos. Quando os isolados foram incubados com aminoácidos, verificou-se alta atividade específica de produção de amônia a partir de fenilalanina, glutamina, Isoleucina, leucina, serina, tirosina e treonina. A análise da diversidade genética dos quatorze isolados com alta atividade específica de produção de amônia pela técnica de BOX-PCR resultou em padrões de bandas distintos entre os isolados e culturas hiperprodutoras de amônia previamente descritas na literatura. Com base nos dados do seqüenciamento do rDNA 16S foi determinado que os isolados 57A, 86A, 99A, 102 e 15A apresentaram identidade de 96 %, 99 %, 93 %, 94 % e 99 % respectivamente, com Clostridium botulinum e o isolado RF2B, oriundo de fezes de suíno, porém ainda não caracterizado. Os isolados 15B e CT2 apresentaram identidade de 94 % e 88 % respectivamente com Clostridium hastiforme. A sensibilidade da microbiota ruminal e dos isolados hiperprodutores de amônia do rúmen à bacteriocina bovicina HC5 e ao ionóforo monensina foi avaliada e os resultados demonstraram que bovicina HC5 inibiu a produção de amônia pela microbiota ruminal e pelos isolados hiperprodutores de amônia caracterizados neste trabalho. Considerando os resultados obtidos neste trabalho, infere-se que microbiota ruminal de bovinos de clima tropical apresentam bactérias com alta atividade específica de produção de amônia relacionadas ao gênero Clostridium que podem contribuir para as perdas de nitrogênio dietético no rúmen.