Caracterização bioquímica e estudos estrutural e termodinâmico de α-galactosidases de Debaryomyces hansenii UFV-1

• Ano de defesa: 2009
• Autor(a) principal: Viana, Pollyanna Amaral
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal; Doutorado em Bioquímica Agrícola; UFV
• Palavras-chave em Português: Alfa-galactosidases; Debaryomyces hansenii; α-galactosidases; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::ENZIMOLOGIA
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/325

O consumo humano de produtos derivados da soja foi limitado pela presença de oligossacarídeos não digeríveis, tais como os α-galacto-oligossacarídeos rafinose e estaquiose (GO). A maioria dos mamíferos, incluindo o homem, não possui α-galactosidase pancreática, necessária para a hidrólise destes açúcares. Entretanto, os GO podem ser fermentados por microrganismos presentes no intestino grosso, produzindo gases, que podem induzir flatulência e outras desordens gastrintestinais. A utilização de microrganismos que expressam α-galactosidase é uma solução promissora à eliminação dos GO, antes que estes alcancem o intestino grosso. No estudo atual, nós relatamos a produção e a purificação das α- galactosidases extracelular e intracelular de Debaryomyces hansenii UFV-1, para estudos de caracterizações moleculares (dicroísmo circular) e cinético-bioquímicas destas enzimas. Nós também realizamos análises termodinâmicas usando a microcalorimetria (DSC), visando o melhor conhecimento das características individuais de cada α-galactosidase, com a finalidade de utilizar estas enzimas na eliminação dos GO em produtos derivados da soja. Células de Debaryomyces hansenii UFV-1, cultivadas em galactose como fonte de carbono, produziram α-galactosidases extracelular e intracelular, com massas moleculares de 54,5 e 54,8 kDa (MALDI-TOF), 60 e 61 kDa (SDS-PAGE), e valores de pI de 5,15 e 4,15, respectivamente. α-Galactosidases extracelular e intracelular desglicosiladas apresentaram massas moleculares de 36 e 40 kDa, com conteúdo de carboidrato de 40 e 34 %, respectivamente. As seqüências do N-terminal das α-galactosidases foram idênticas. α-Galactosidases intracelular e extracelular de D. hansenii UFV-1 mostraram poucas variações em seus conteúdos de aminoácidos. α-Galactosidase intracelular mostrou menor termoestabilidade quando comparada com a enzima extracelular. α-Galactosidase extracelular de D. hansenii UFV-1 apresentou maior Kcat do que a enzima intracelular (7,16 vs 3,29 s-1, respectivamente), para o substrato pNPαGal. O valores de Kcat da enzima intracelular para melibiose, estaquiose e rafinose foram 0,03, 6,05 e 4,12 s-1, respectivamente. Incubação da isoforma intracelular com extrato hidrossolúvel da soja por 6 h a 55 oC reduziu os teores de estaquiose e rafinose em 100 e 73 %, respectivamente. Pode-se observar que, a α-galactosidase de D. hansenii UFV-1 foi eficiente na redução dos GO presentes em produtos derivados da soja, e é apropriada para uso industrial no processamento destes açúcares. Derivados de galactopiranosídeos foram sintetizados para explicar atividades inibitórias das α-galactosidases de D. hansenii UFV-1. α- D-Galactopiranosídeo de metila foi o inibidor mais potente comparado aos demais testados, com valores de Ki de 0,82 e 1,12 mM, para as enzimas extracelular e intracelular, respectivamente. A presença do grupo hidroxila na posição C-6 foi importante para o reconhecimento pelas α-galactosidases de D. hansenii UFV-1. As glicoproteínas foram completamente hidrolisadas com 6 M de HCl a 80 °C, liberando os monossacarídeos após 2 h de incubação. A presença de galactose e manose foram observadas na α-galactosidase extracelular e xilose na enzima intracelular. Propriedades espectroscópicas, cinéticas e termodinâmicas foram determinadas para α-galactosidases de D. hansenii UFV-1. Efeitos de pH e temperatura na estrutura destas enzimas foram investigadas usando Dicroísmo Circular (CD). α-Galactosidases de D. hansenii UFV-1 apresentaram composições de estruturas secundárias (α-hélice, folhas-β paralelas e voltas-β) semelhantes. Calorimetria de Varredura Diferencial (DSC) foi utilizada para a determinação de alguns parâmetros termodinâmicos durante desnaturação térmica protéica. Imediatamente, não foi observada reversibilidade da desnaturação térmica para α-galactosidases de D. hansenii UFV-1, entretanto, ocorreu como um processo termodinamicamente controlado. α-Galactosidase extracelular, em pH 5,5, mostrou um valor de Tm menor (86,1 °C) quando comparado com a enzima intracelular (87,3 °C). O índice relativo de cooperatividade para a α-galactosidase intracelular (ΔT1/2 = 5,0 ºC) foi menor do que para a enzima extracelular (ΔT1/2 = 5,6 ºC). Assim, os dados de CD e DSC sugerem que, as duas enzimas tenham comportamentos diferentes e discretos, embora possuam estrutura secundária similar. A energia de ativação de Arrhenius reportada para as α- galactosidases extracelular e intracelular de D. hansenii UFV-1 (88 e 95 KJ/mol, respectivamente) foi correspondentemente elevada e indica uma mudança química transiente considerável durante o processo de ligação. As condições testadas para a cristalização da α- galactosidase extracelular de D. hansenii UFV-1 foram os Kits 1 e 2 (Crystal Screen), utilizando a técnica da difusão de vapor em gota suspensa. Em determinadas condições houve aparecimento de cristais, entretanto, análises de difração em raios-X indicaram a formação dos sais usados na cristalização.