Análises moleculares das vias de sinalização de morte celular originadas no retículo endoplasmático

• Ano de defesa: 2010
• Autor(a) principal: Reis, Pedro Augusto Braga dos
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Viçosa; BR; Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal; Mestrado em Bioquímica Agrícola; UFV
• Palavras-chave em Português: Vias de sinalização; Retículo endoplasmático; Morte celular; Pathways signalling; Endoplasmic reticulum; Cell death; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR
• Link de acesso: http://locus.ufv.br/handle/123456789/2419

Estresses bióticos e abióticos são responsáveis por grandes perdas da produção vegetal em todo o mundo. Consequentemente, a elucidação dos mecanismos pelos quais estes organismos respondem e se adaptam a tais condições tem se tornado fundamental para o desenvolvimento de plantas melhor adaptadas. Recentemente, foi identificada uma via de sinalização inédita, mediada por proteínas ricas em asparagina (NRPs), que transduz sinais de morte celular originados por estresses no retículo endoplasmático (RE) e estresse osmótico. Esta via de resposta a estresses foi designada via integrativa por integrar sinais de estresses no RE e osmótico em uma resposta adaptativa comum e potencializada. Os objetivos da presente investigação foram (i) identificar componentes da via integrativa e (ii) analisar a função de BiP, um regulador de vias de resposta a estresses no RE, como atenuador de morte celular programada em plantas e sua possível conexão com a via integrativa. Inicialmente, foi construída uma biblioteca de cDNA duplo-híbrido de soja, preparado de folhas estressadas por tunicamicina, um indutor de estresse no RE, e PEG (estresse osmótico). Por meio de varredura de bibliotecas duplohíbrido de cDNA, foi identificada uma proteína de soja, pertencente à famíliaUSP (universal stress protein) e aqui designada GmUspA, pela sua capacidade de interagir com NRP-B. Interação de GmUspA com NRP-B é mediada pela região carboxi-terminal da proteína, enquanto que a proteína GmUspA completa perde a habilidade de interagir com NRP-B no sistema duplo híbrido de leveduras, sugerindo que a formação do complexo in vivo pode ser dependente de mudança de conformação induzida por ligantes. O gene GmuspA exibe um padrão de expressão similar aos genes NRP-A e NRP-B, sendo regulados positivamente por estresses do RE e osmótico, embora com cinética de indução diferenciada. Além disso, foi demonstrado por microscopia confocal que a proteína GmUspA fusionada a GFP localiza-se no citoplasma, possibilitando interações com a proteína NRP-B associada a membranas, o que foi demonstrado por "immunoblottings" de fracões microssomais. Coletivamente, estes resultados indicam que a interação entre NRP-B e GmUspA pode potencialmente ocorrer in vivo e ser biologicamente relevante. Para avaliar a função de BiP como modulador de morte celular programada (PCD) em plantas, os níveis de BiP foram manipulados em plantas transgênicas desafiadas com indutores químicos de morte celular. Foi demonstrado que a superexpressão de BiP atenuou morte celular induzida por estresse no RE, estresse osmótico e por cicloheximida. Expressão ectópica de BiP em plântulas transgênicas de soja reduziu as lesões necróticas de folhas cotiledonárias causadas pelos indutores de morte celular, tunicamicina e cicloheximida, e manteve o turgor foliar sob condições de desidratação induzida por PEG. A atenuação de morte celular mediada por BiP foi confirmada pela falta de indução e, em alguns casos, pelo atraso na expressão de genes associados à senescência em plântulas transgênicas super expressando BiP. Este fenótipo de morte celular atenuada foi coordenado com decréscimo ou atraso na indução dos marcadores de morte celular NRP-A e NRP-B que estão envolvidos em transduzir um sinal de PCD emanado do estresse no RE e estresse osmótico. Um direto envolvimento de BiP na modulação da resposta de sinalização de morte celular mediada por NRPs foi examinado por meio de um ensaio de expressão transiente por agroinoculação em folhas de tabaco de linhagens transgênicas com expressão aumentada (linhagem senso) ou reduzida (linhagem antiseno) de BiP. Super expressão de BiP preveniu clorose induzida por expressão de NRPs em setores foliares agroinoculados, enquanto que silenciamento de BiP endógeno em linhagens antisenso acelerou o processo de senescência. Estes fenótipos de morte celular foram confirmados pelo teor de clorofila e pelo padrão de indução de genes associados à senescência em linhagens senso e antisenso. Coletivamente, estes resultados indicam uma correlação direta entre os níveis de BiP e senescência induzida por NRPs e apontam favoravelmente para um envolvimento direto de BiP como modulador da resposta de morte celular programada mediada por NRPs.