Estudo da ação do peróxido de hidrogênio (H2O2) e do óxido nítrico (NO●) na modulação da hematopoese

• Ano de defesa: 2014
• Autor(a) principal: Nogueira-Pedro, Amanda [UNIFESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
• Palavras-chave em Português: Células-tronco hematopoéticas; Peróxido de hidrogênio; Óxido nítrico; Proliferação de células; Diferenciação celular
• Link de acesso: http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/23038

Nos ultimos anos, estudos tem visado compreender a biologia das celulas-tronco, especialmente as celulas-tronco hematopoeticas (CTHs). Neste contexto um novo foco foi dado aos estudos das especies reativas de oxigenio (EROs) e nitrogenio (ERNs): o de seu papel na manutencao do nicho hematopoietico e sua influencia nos processos de auto-renovacao, proliferacao e diferenciacao das CTHs. As CTHs localizam-se preferencialmente no nicho endosteal, afastadas dos vasos sanguineos em quiescencia, enquanto que a sua progenie em processo de diferenciacao encontra-se no nicho vascular, onde ha maior atividade celular, concentracao de oxigenio e possivelmente niveis mais elevados de EROs e ERNs. Isto sugere que a ausencia destas especies reativas esteja relacionada com o estado quiescente das CTHs e que sua presenca favoreca a proliferacao e/ou diferenciacao destas celulas. Considerando este cenario, neste trabalho foi avaliado se o peroxido de hidrogenio (H2O2) e o oxido nitrico (NO●) estao diretamente envolvidos na proliferacao, diferenciacao e morte das celulas hematopoeticas. Na primeira etapa do estudo foi avaliada a capacidade do H2O2 em modular a hematopoese, avaliando seus efeitos em 3 modelos de celulas hematopoeticas, sendo dois de celulas normais (celulas hematopoeticas obtidas da medula ossea de camundongo e celulas de sangue de cordao umbilical humano) e um modelo tumoral (celulas leucemicas pro-mielociticas humanas provenientes da linhagem HL-60). Em cada modelo, os efeitos do H2O2 foram avaliados nas tanto nas celulas totais, quanto nas populacoes de celulas-tronco e progenitoras. Foi visto in vitro que o H2O2 em baixa concentracao (5 μM) leva a morte das celulas leucemicas totais HL-60, sem afetar a viabilidade das celulas hematopoeticas normais humanas e murinas, efeito este relacionado com a diminuicao da fosforilacao da Akt. As alteracoes produzidas pelo H2O2 nas populacoes primitivas ocorreram somente nas celulas-tronco leucemicas, as quais aumentaram em percentual, mas apresentaram capacidade clonogenica prejudicada. Alem disso, a expressao de marcadores mielomonociticos, relacionados com o estado diferenciado das celulas hematopoeticas, nao foi alterada mediante o estimulo com H2O2, mostrando que nas condicoes avaliadas o H2O2 nao induziu a diferenciacao celular. Entretanto, os dados obtidos a partir da quantificacao de colonias de granulocitos e macrofagos (CFU-GM) evidenciaram a maior capacidade de formacao de colonias mieloides pelas celulas hematopoeticas murinas, indicando o potencial de diferenciacao induzido pelo H2O2 neste modelo. Na segunda etapa do estudo foi avaliada a acao do NO● como modulador hematopoetico utilizando dois modelos para a geracao de NO●: um modelo in vitro, onde as celulas hematopoeticas totais murinas foram estimuladas com o NO● gerado por celulas endoteliais estimuladas com carbacol (CCh) em um sistema transwell; e um modelo in vivo, onde camundongos foram tratados intraperitonealmente com S-Nitroso-N-Acetil-D,L-Penicilamina (SNAP), um doador exogeno de NO●. Em ambos os modelos, verificou-se que o NO● induziu a diferenciacao celular pelo comprometimento das CTHs preferencialmente na linhagem mieloide. In vivo foi visto ainda que o NO● induz a expansao do pool de CTHs (observado no primeiro dia de tratamento) previamente a sua diferenciacao (observada no terceiro dia de tratamento), o que de acordo com a avaliacao da reconstituicao medular apos transplante, trata-se da proliferacao de CTHs de curta-duracao e/ou progenitores multipotentes. Na proliferacao das CTHs houve a supressao da transcricao dos genes relacionados com a diferenciacao hematopoetica, assim como a ativacao de proteinas de diferentes vias de sinalizacao (Akt, ERK1/2, PKC, p38, c-Myc) e o aumento da expressao de moleculas de membrana relacionadas com a manutencao das CTHs no nicho endosteal (Cx43, CaR, PECAM-1, Notch-1). Ja a diferenciacao mieloide envolveu a superexpressao dos fatores de transcricao C/EBPα e PU.1 e supressao de GATA-3 e Ikz-3 (ambos envolvidos com a progenie linfoide), e a diminuicao de expressao/fosforilacao das proteinas avaliadas, exceto a PECAM-1, cujos niveis se mantiveram inalterados, e a Stat5 que foi ativada durante a diferenciacao das CTHs. Ainda, a modulacao redox envolvendo alteracoes da atividade enzimatica intracelular (Cat e SOD) e dos niveis de GSH, sugerem uma resposta adaptativa das celulas ao aumento das EROs em prol da manutencao da viabilidade celular e possivelmente do destino das CTHs durante os processo de proliferacao e diferenciacao destas induzido pelo NO●. Coletivamente, estes dados mostram que tanto o H2O2 quanto o NO● sao importantes reguladores da hematopoese, cujos efeitos sao dependentes da dose/concentracao de estimulo destes, do tipo ou populacao de celula assim como do microambiente celular