Papel fisiológico das microvesículas derivadas de macrófagos M2 na doença renal aguda

• Ano de defesa: 2019
• Autor(a) principal: Henao Agudelo, Juan Sebastian [UNIFESP]
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo
• Palavras-chave em Português: macrófagos; microvesículas; exossomos; imunoregulação; doença renal
• Link de acesso: https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/51926

Introdução: A renoproteção induzida por macrófagos (Mɸs) M2 é principalmente mediada por fatores parácrinos. Recentemente foi demonstrado que Mɸs liberam vesículas extracelulares. Nesse sentido, foi demonstrado que Mɸs-M2 secretam vesículas com material genético associado à polarização do tipo M2. Desse modo, nós hipotetizamos, que exossomos e microvesículas derivadas de Mɸs-M2 possam conter microRNAs e proteínas bioativas que converteriam Mɸs pró-inflamatórios (Mɸs-M1) em Mɸs anti-inflamatórios M2, os quais potencializariam processos renoprotetores na LRA através da geração de um microambiente anti-inflamatório. Nesse contexto, objetivou-se avaliar o papel imunoregulador das vesículas de Mɸs-M2 (MVs-M2) em Mɸs com perfil M1 e verificou-se o seu papel no desenvolvimento e progressão da doença renal aguda. Métodos: O meio condicionado de Mɸs-M2 livre de recombinante foi ultracentrifugado em 100.000g para extração de vesículas. Em seguida, Mɸs derivados da medula óssea foram tratados com MVs-M2 e subsequentemente, ativados por LPS/IFN- por 24 horas. Complementarmente, o efeito das MVs-M2 foi avaliado num modelo experimental de glomeruloesclerose segmentar e focal (GESF) induzida por adriamicina e na lesão renal aguda promovida por cisplatina em camundongos machos C57BL6. O material coletado nos experimentos, foi avaliado por qPCR, Citometria de Fluxo, PCR array, Western Blott, array de citocinas (CBA), NanoSitgh, e finalmente microscopias de: fluorescência, de transmissão e de varredura. Resultados: Inicialmente documentamos a capacidade de Mɸs-M2 de produzir uma população heterogênea de microvesículas e exossomos, possuindo alta variabilidade em marcadores de superfície associados à: vesículas, macrófagos, ativação M2, monócitos e células mieloides. Neste contexto, as vesículas exibiram elevada expressão de CD9, F4/80, CD206, CD11b e ly6C respectivamente. A análise de NanoSight revelou que as vesículas de Mɸs-M2 têm um tamanho médio de ~144,8 nm e uma concentração de ~9,00 x109 partículas/mL. Também foi verificada a capacidade de incorporação das MVs-M2 nos Mɸs-M1. Nos experimentos in vitro, as MVs-M2 reduziu CD86, IL-1, TNF-, MCP-1 e NLRP3 nos Mɸs-M1. Por outro lado, elas aumentaram o receptor de manose, expressão de Arg-1 e atividade enzimática da arginase nesses mesmos macrófagos tratados. Adicionalmente, análises intracelulares revelou que MVs-M2 inibe a secreção de IL-6 em Mɸs-M1. Complementarmente, analises de PCR array mostrou que 21 miRNAs estavam regulados positivamente e 6 estavam regulados negativamente. Curiosamente, os miRNAs hiper-regulados foram particularmente associados à polarização M2. Assim, quando realizados analises de bioinformática com estes miRNAs alterados, foi apontado que a via de sinalização PI3K/AKT poderia estar sendo regulada. Posteriormente, foi confirmado que AKT fosforilado se encontrava significativamente reduzida em Mɸs-M1 tratados com MVs-M2. Finalmente, camundongos tratados com MVs-M2 e expostos a GESFs foram protegidos contra a taxa de perda de peso corporal e proteinúria, ao mesmo tempo que apresentaram a expressão elevada de genes associados com funções podocitarias. Em relação à LRA induzida por cisplatina observamos que MVs-M2 aumentou a expressão de Mɸs com funções anti-inflamatórias e reduziu a presença de neutrófilos infiltrantes. Conclusões: Esses resultados sugerem que as MVs-M2 têm propriedades imunoreguladoras em Mɸs-M1 via modulação de miRNAs, os quais atuam na sinalização AKT, fenômeno este que promove propriedades anti-inflamatórias nos modelos de lesão renal aguda.