Construção de scFv anti-FGF2 a partir do hibridoma secretor do MAb 3F12E7

• Ano de defesa: 2015
• Autor(a) principal: Santos, Deny Anderson dos [UNIFESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
• Palavras-chave em Português: Fibroblast growth factor 2; Single chain antibodies; Fibroblast; Antagonist growth factor 2; Fatores de crescimento de fibroblastos; Anticorpos de cadeia única; Antagonistas e inibidores; Melanoma; Inibidores da angiogênese
• Link de acesso: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=2395069; http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/46820

Já foi demonstrado o potencial da terapia antiangiogênica, tanto que sua utilização foi aprovada para o tratamento de alguns tumores, quando associada a terapias convencionais citotóxicas. Dentre as drogas antiangiogênicas, encontram-se os anticorpos monoclonais contra fatores angiogênicos. O anticorpo monoclonal (MAb) anti-hFGF2 3F12E7, produzido por nosso grupo, por meio de imunização com o gene FGF2, mostrou atividade inibidora de crescimento de tumor, bem como de metástases, em estudos pré-clínicos. Além disso, o MAb 3F12E7 parece ter utilidade em métodos de diagnóstico. Com o objetivo de melhorar a capacidade deste anticorpo, propusemos a construção de um fragmento variável de cadeia única (scFv) de 3F12E7. Os anticorpos na forma de scFv, uma vez que são moléculas de proteína pequenas, podem infiltrar-se mais facilmente em massas tumorais sólidas e podem ter seu potencial terapêutico e diagnóstico aumentado. Além desta vantagem sobre o uso do anticorpo completo, a scFv, quando injetada em seres humanos, não provoca resposta imune contra marcadores iso e alotípicos presentes na porção constante das cadeias de imunoglobulina. Assim, RNA total foi isolado de células de hibridoma 3F12E7. O cDNA dos fragmentos variáveis da cadeia pesada (FvH) e leve (FvL) foram obtidos com a utilização de oligonucleotídeos específicos. Os fragmentos de DNA que codificam para os domínios FvH e FvL de 3F12E7 foram então amplificados por PCR. Fragmentos de DNA de 325 pb e 340 pb, que correspondem a FvL e FvH, respectivamente, foram purificados a partir do gel de agarose após eletroforese e ligados ao vetor pGEM-T Easy®. Bactérias competentes foram transformadas 85 e clonadas e as colônias resistentes à ampicilina foram selecionadas, expandidas e submetidas a minipreparações para isolamento do plasmídeo. Os plasmídeos foram selecionados, usando enzimas de restrição, sequenciados e analisados quanto à homologia com outras imunoglobulinas. Após confirmação de homologia, foi possível desenhar um fragmento variável de cadeia única, que contém um ?linker? que codifica para uma sequência de 15 aminoácidos (Gly4-Ser)3, e que une os fragmentos FvL e FvH. Além disso, foi incluído um peptídeo sinal, para orientar a expressão da scFv em superfície celular. O vetor pcDNA3.1, contendo a construção, foi usado para transfectar células de mamífero. Assim, por ELISA e imunofluorescência, foi possível avaliar a capacidade da scFv 3F12E7 em reconhecer FGF-2. A scFv 3F12E7, obtida a partir do hibridoma 3F12E7, reconhece FGF-2.