Expressão de um gene codificador de cisteína proteinase de Leishmania(Leshmania) amazonensis em sistema bacteriano e avaliação das respostas imunes induzidas pela proteína recombinante em modelo murino

• Ano de defesa: 2008
• Autor(a) principal: Fedeli, Carlos Eduardo Cardoso [UNIFESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
• Palavras-chave em Português: Leishmania; Leishmaniose cutânea; Cisteína endopeptidases
• Link de acesso: http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/24397

O enfoque do nosso trabalho foi avaliar a antigenicidade de uma cisteína proteinase recombinante de Leishmania (Leishmania) amazonensis e a capacidade protetora desse antígeno contra a infecção homóloga em camundongos BALB/c. Um fragmento de 500 pb do gene Lacys24, codificador de uma isoforma de cisteína proteinase de L. (L.) amazonensis previamente clonado em nosso laboratório, foi subclonado e expresso no vetor bacteriano pHis, originando uma proteína recombinante de 24 kDa, rLacys24. Por experimentos de “Western blotting” foi demonstrado que anticorpos produzidos contra essa proteína reconhecem uma banda de 30 kDa do extrato de amastigotas de L. (L.) amazonensis, indicando que a rLacys24 corresponde a uma isoforma de cisteína proteinase de 30 kDa abundantemente expressa nesses parasitas. A antigenicidade da rLacys24 foi avaliada pela análise das populações de linfócitos dos camundongos BALB/c previamente imunizados com a proteína recombinante mais Propionibacterium acnes ou adjuvante completo de Freund (ACF) como adjuvantes. A análise por citometria de fluxo dos linfócitos provindos dos linfonodos inguinais e poplíteos dos animais imunizados com a rLacys24 + ACF por via subcutânea mostrou um aumento significante da expressão de linfócitos CD8+ comparada à dos controles que receberam apenas ACF. Quanto à CD4+ , não houve diferença na expressão dessa população de linfócitos entre os controles e os animais imunizados com a rLacys24. Por outro lado, foi baixa a expressão de linfócitos CD4+ e CD8+ no baço dos camundongos imunizados com a rLacys24 + P. acnes pela via intraperitoneal. O ensaio de citotoxicidade dos linfócitos dos camundongos imunizados com a rLacys24 + ACF foi realizado utilizando-se como células-alvo macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c infectados com L. (L.) amazonensis. A lise dos macrófagos infectados na presença dos linfócitos dos animais imunizados com a rLacys24 foi significantemente maior que a observada quando as células-alvo foram incubadas com os linfócitos dos animais controle. A imunização ativa dos camundongos BALB/c com a rLacys24 + ACF resultou em pequeno, porém significante decréscimo das lesões das patas dos animais após o desafio com a L. (L.) amazonensis, enquanto que nos animais imunizados com a rLacys24 + P. acnes as lesões apresentaram aumento gradativo até três meses após o desafio. No outro esquema de imunização avaliado, os animais foram imunizados com a cisteína proteinase de amastigotas de L. (L.) chagasi, rLdccys, além da rLacys24, e P. acnes como adjuvante e desafiados com a L. (L.) amazonensis. A avaliação das respostas imunes dos animais imunizados foi realizada por citometira de fluxo e pela detecção por ELISPOT de IFN-γ, IL-4 e IL-10 nas culturas dos linfócitos dos animais três meses após o desafio. Em todos os animais imunizados houve predomínio da expressão de linfócitos CD4+ , enquanto que a dos linfócitos CD8+ foi baixa (em torno de 8-10%). IFN-γ foi secretado pelos linfócitos isolados de todos os animais estudados, não tendo havido diferenças significantes na secreção dessa linfocina entre os animais imunizados com os antígenos recombinantes e os controles que receberam apenas a P. acnes. Enquanto IL-10 não foi detectada nas culturas de linfócitos de nenhum dos animais imunizados, IL-4 foi secretada pelos linfócitos de todos os animais estudados. Entretanto, a expressão da IL-4 foi significantemente menor nas culturas de linfócitos dos animais imunizados com os antígenos recombinantes comparada à dos controles. Não foram observadas diferenças do tamanho das lesões das patas dos camundongos imunizados com os antígenos recombinantes em relação aos controles, sendo esses resultados confirmados quando a infecção dos animais foi avaliada pelo crescimento em meio axênico dos parasitas isolados das lesões. Apesar da reduzida proteção conferida pela rLacys24, os dados do presente trabalho sugerem que esse antígeno pode ser útil em novos esquemas de imunização que induzam respostas mediadas por linfócitos CD4+ e CD8+ mais eficazes contra a infecção pela L. (L.) amazonensis.