Utilização do gene codificador da cisteína proteinase de 30kDa de Leishmania(Leishmania) chagasi (Ldccys1) e da proteína recombinante (rLdccys1) em novos esquemas de imunização em modelo murino

• Ano de defesa: 2006
• Autor(a) principal: Ferreira, Josie Haydée Lima [UNIFESP]
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
• Palavras-chave em Português: Leishmania; Leishmaniose visceral; Cisteína endopeptidases
• Link de acesso: http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/21536

O enfoque do nosso trabalho foi avaliar as respostas linfoproliferativas protetoras desencadeadas em camundongos BALB/c pela imunização com o gene Ldccys1 codificador da cisteína proteinase de 30 kDa de Leishmania (L.) chagasi (p30) e comparar essas respostas com as induzidas pela cisteína proteinase recombinante rLdccys1. O gene Ldccys1, previamente clonado em nosso laboratório, foi subclonado e expresso no vetor bacteriano pHis, originando uma proteína recombinante de 47 kDa, rLdccys1. Essa proteína foi reconhecida, em experimentos de “Western blotting”, pelo anticorpo monoclonal 2E5D3 reativo com a p30 nativa do parasita, mostrando que a rLdccys1 corresponde à cisteína proteinase de 30 kDa de L. (L.) chagasi. A antigenicidade da rLdccys1 foi avaliada pelas respostas linfoproliferativas dos camundongos BALB/c previamente imunizados com a proteína recombinante e Propionibacterium acnes ou BCG como adjuvantes, por via subcutânea ou intraperitoneal, e reestímulo in vitro com a rLdccys1 ou o extrato protéico de amastigotas de L. (L.) chagasi (PAM). O reestímulo com a rLdccys1 resultou em respostas linfoproliferativas superiores às induzidas pelo PAM, independente da via de imunização ou do adjuvante utilizado. Foi demonstrado que P. acnes e BCG representam adjuvantes apropriados para a imunização dos animais com a rLdccys1 pela via subcutânea (índices de estimulação em torno de 4-6), enquanto que os animais imunizados com rLdccys1 + BCG pela via intraperitoneal apresentaram respostas linfoproliferativas muito baixas. Com P. acnes a imunização pela via intraperitoneal induziu respostas significantemente superiores às obtidas com a imunização pela via subcutânea. IFN-γ foi secretado em concentrações semelhantes pelos esplenócitos dos animais imunizados com a rLdccys1 + P. acnes por ambas as vias. IFN-γ foi secretado pelos esplenócitos dos animais imunizados com rLdccys1 + BCG em concentrações cerca de cinco vezes maiores às obtidas nos sobrenadantes dos linfonodos desses animais. IL-4 e IL-10 não foram detectadas nos sobrenadantes dos linfócitos de nenhum dos grupos de camundongos imunizados com a rLdccys1. A imunização ativa dos camundongos BALB/c com a rLdccys1 resultou no decréscimo de cerca de 100 vezes da carga parasitária desses animais comparada à dos que receberam PBS ou apenas o adjuvante, como avaliado pelo ensaio da diluição limitante. O grau de proteção conferido pela rLdccys1 foi semelhante quando se utilizou BCG ou P. acnes como adjuvante e levou à secreção de IFN-γ e produção de óxido nítrico nos sobrenadantes das culturas de esplenócitos dos camundongos dois meses e meio após o desafio com amastigotas de L. (L.) chagasi. A imunização com o gene Ldccys1 e reforço com a rLdccys1 induziu forte resposta humoral nos camundongos BALB/c, com produção de anticorpos IgG2a. Os esplenócitos desses animais apresentaram respostas linfoproliferativas em presença da rLdccys1 mediadas por IFN-γ e produção de óxido nítrico. A imunização gênica levou ao decréscimo de 1.000 vezes da carga parasitária dos camundongos imunizados dois meses e meio após a infecção com amastigotas de L. (L.) chagasi comparada à dos controles que receberam PBS ou o plasmídio pcDNA3 vazio. As respostas imunes protetoras com a redução da carga parasitária nos camundongos BALB/c imunizados com a cisteína proteinase recombinante de L. (L.) chagasi e com o gene Ldccys1 abrem perspectivas de estender esses estudos a outros modelos animais como o cão, um importante reservatório da leishmaniose visceral em nosso país.