Citólise mediada por leishporina de Leishmania (Leishmania) amazonensis: requisitos para a ligação da citolisina à membrana, visualização de estruturas pore-like e estratégias para sua identificação

• Ano de defesa: 2010
• Autor(a) principal: Thiago de Castro Gomes
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Universidade Federal de Minas Gerais; UFMG
• Palavras-chave em Português: estruturas pore-like; Leishmania; citolisina; Leishporina; Bioquímica; Leishmania amazonensis
• Link de acesso: http://hdl.handle.net/1843/UCSD-8HFK4K

Chamamos de leishporina uma citolisina que foi descrita pelo nosso grupo inicialmente em L. amazonensis, mas cuja atividade citolítica foi também detectada em L. major, L. panamensis e L. guyanensis (Noronha,1996; Noronha et al., 1996). A atividade citolítica de L. amazonensis foi detectada em promastigotas e amastigotas, mas toda a caracterização desta atividade foi feita em promastigotas. Assim, nosso grupo mostrou que promastigotas contêm uma atividade lítica capaz de lisar hemácias e células nucleadas, incluindo o macrófago, a célula hospedeira do gênero Leishmania (Noronha et al., 1996). Posteriormente, utilizando a técnica de patch-clamp, nosso grupo mostrou que a lesão celular causada pelo extrato do parasita é mediada pela formação de poros não seletivos na membrana-alvo, demonstrando que a citolisina de L. amazonensis é uma citolisina formadora de poros, de onde veio o nome leishporina (Noronha et al., 2000). O fato de parasitas do gênero Leishmania, causadores de diversas formas de leishmaniose, possuírem uma molécula formadora de poros gera a questão óbvia de qual seria a sua função. A resposta a esta questão depende, no entanto, de conhecermos a identidade da leishporina. Embora já tenhamos determinado várias características desta citolisina e do seu mecanismo de ação (Noronha et al., 1994; Noronha et al., 1996; Noronha et al., 2000; Almeida-Campos & Horta, 2000), não sabíamos sobre sua identidade molecular. Na busca dessa identidade, os resultados do presente trabalho utilizamos duas abordagens diferentes que, além de nos apontar para algumas moléculas candidatas a mediarem a atividade formadora de poros, elucidaram aspectos importantes sobre os requisitos necessários para que ocorra a lise. Assim, demonstramos que a leishporina se liga às membranas alvo e são removidas do extrato por hemácias ou lipossomos compostos de DPPC. Demonstramos ainda que o sítio de ligação da citolisina e o requisito mínimo para sua atuação são fosfolipídeos das membranas-alvo. Quanto à identificação da leishporina, utilizando técnicas de cromatografia, obtivemos várias frações líticas de extratos ricos em membrana de promastigotas, onde se localiza a leishporina. Algumas delas possuíam apenas lisofosfolipídeos e em outras, havia também proteínas, sendo que uma delas foi identificada como a HSP70 de L. amazonensis. A ligação seletiva da leishporina em lipossomos de DPPC também apontou para algumas proteínas como candidatas, sendo que uma delas, de PM por volta de 48 kDa, possivelmente a gp46 que sabidamente se ligou aos lipossomos. Outras proteínas que se ligaram aos lipossomos foram: a gp63, a beta-tubulina, a GAPDH, e uma de 80 kDa, ainda não identificada. A termolabilidade do extrato total, em contraposição à termoresistência dos lisofosfolipídeos bem como a termoresistência do extrato tratado com proteinase K, nos fez hipotetizar que a leishporina seja um complexo lipoprotéico cuja parte lipídica seria a responsável pela atividade formadora de poros e a parte protéica possa ser algumas das proteínas já identificadas ou apenas seu inibidor. Além disso, pela primeira vez, fomos capazes de visualizar, por Microscopia de Força Atômica, estruturas pore-like na superfície de hemácias e de filmes lipídicos derivados de lipossomos de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) lisados pela leishporina.