Detalhes bibliográficos
| Ano de defesa: |
2016 |
| Autor(a) principal: |
Porcino, Gabriane Nascimento
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| Orientador(a): |
Vasconcelos, Eveline Gomes
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| Banca de defesa: |
Dias, Sivia Regina Costa
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Maia, Ana Carolina Ribeiro Gomes
,
Coimbra, Elaine Soares
,
Almeida, Patrícia Elaine de
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| Tipo de documento: |
Tese
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| Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
| Idioma: |
por |
| Instituição de defesa: |
Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF)
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| Programa de Pós-Graduação: |
Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas: Imunologia e Doenças Infecto-Parasitárias/Genética e Biotecnologia
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| Departamento: |
ICB – Instituto de Ciências Biológicas
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| País: |
Brasil
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| Palavras-chave em Português: |
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| Área do conhecimento CNPq: |
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| Link de acesso: |
https://repositorio.ufjf.br/jspui/handle/ufjf/5597
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Resumo: |
A atividade catalítica de nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase (NTPDase) foi recentemente caracterizada em promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis (Lb), e o domínio B (r82-121) antigênico e conservado, específico da NTPDase 1 foi identificado. Neste trabalho, anticorpos policlonais de camundongos produzidos contra dois peptídeos sintéticos derivados deste domínio (LbB1LJ, r82-103; LbB2LJ, r102-121), e anticorpos produzidos contra os peptídeos potB1LJ e potB2LJ, de alta identidade com LbB1LJ e LbB2LJ respectivamente, foram usados como ferramentas de estudo desta proteína. Os anticorpos anti-LbB1LJ ou anti-LbB2LJ, imobilizados em proteína A-Sepharose, imunoprecipitaram a NTPDase 1 de 48 kDa, e depletarem aproximadamente 40% da atividade fosfohidrolítica da preparação de Lb homogeneizada em detergente. Por imunocitoquímica e análise ultraestrutural, usando os anticorpos anti-LbB1LJ, anti-LbB2LJ ou anti-potB1LJ, a NTPDase 1 foi identificada na superfície, vesículas citoplasmáticas, mitocôndria, cinetoplasto, flagelo e bolsa flagelar, e núcleo de promastigotas. Em adição, a NTPDase 1 foi isolada de fração mitocondrial de promastigotas por gel não desnaturante, e sua expressão e identidade foram confirmadas por medidas de atividade enzimática, “Western blots” e espectrometria de massas. As atividades ATPásica e ADPásica da preparação de Lb homogeneizada em detergente foram parcialmente inibidas por anticorpos anti-LbB1LJ ou anti-potB1LJ (43-79%), sendo mais efetivos que a inibição por anticorpos anti-LbB2LJ ou anti-potB2LJ (18-60%). Em adição, os soros imunes anti-LbB1LJ ou antipotB1LJ (67-73%) e anti-LbB2LJ ou anti-potB2LJ (33-40%) foram citotóxicos, reduzindo significativamente o crescimento de promastigotas in vitro. Em “Western blots” e por análises em microscópio confocal de varredura a laser, os anticorpos produzidos contra o domínio B confirmaram a expressão e identidade da NTPDase 1 em amastigotas intracelulares e, também, amastigotas livres recuperadas de células Vero. Em conjunto, os resultados apontam o domínio B conservado da NTPDase 1 de Leishmania (V.) braziliensis como um importante alvo para o desenho de inibidores e a aplicação potencial dessas biomoléculas em protocolos experimentais de controle da leishmaniose. Os ácidos N-alquilaminoalcanotiossulfúricos (AAATs), os quais não têm efeito citotóxico in vitro ou in vivo, reduziram a proliferação in vitro de amastigotas intracelulares, sendo os mais efetivos o SIPA, SSEC e IBSS com CI50 de 24-35 μM. O NPSO, SXIP e TBSO foram menos efetivos com CI50 de 54 a >100 μM. Com exceção do TBSO, todos os outros AAATs inibiram parcialmente a atividade ATPásica e/ou ADPásica da preparação de promastigotas. O SIPA foi também um efetivo leishmanicida quando testado sobre amastigotas recuperadas de células Vero, com CI50 20 μM e, em adição, foi capaz de reduzir as atividades ATPásica e ADPásica de homogeneizado destes parasitos sugerindo um Ki de 10-100 μM. Além disso, SIPA 30 μM reduziu significativamente 28% do potencial de membrana mitocondrial, podendo ser este um dos mecanismos pelo qual os AAATs são leishmanicidas. A NTPDase 1 pode ter um papel fundamental na atividade mitocondrial, uma nova hipótese a ser explorada, e ser o alvo dos AAATs, os quais foram testados pela primeira vez em tripanosomatídeos e caracterizados neste trabalho como novos compostos leishmanicidas. |
